【毕业学位论文】（Word原稿）大分子拥挤环境中朊蛋白错误折叠机制研究

分类 号 密 级 编 号 10486 武 汉 大 学 博 士 学 位 论 文 大分子拥挤环境中朊蛋白错误折叠机制研究 研 究 生 姓 名 ：周拯 指导教师姓名、职称：梁毅 教授、博导 学 科 、 专 业 名 称 ：生物学 生物化学与分子生物学 研究方向 ： 结构生物学 二零零九年十月 i 009/10/26 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论 文没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，否则 ， 本人愿意承担由此而产生的法律责任和法律后果，特此郑重声明 。 学位论文作者 （ 签名 ） ： 年月 日 论文创新点 大分子拥挤环境是细胞客观存在的真实环境，其对于各种生物大分子物质在体内的行为有着重要的影响。我们以与传染性海绵样脑病密切相关的朊蛋白作为研究对象，利用硫黄素 T 荧光法、刚果红染色法等经典淀粉样纤维研究方法，结合圆二色光谱、 光、紫外浊度法等生物物理手段，研究了 朊蛋白 在大分子拥挤环境中错误折叠形成淀粉样纤维的动力学过程，进而以透射电 子显微镜、原子力显微镜直接观察 生成 纤维 的 形态学特征。并进一步研究了大分子拥挤环境中朊蛋白形成 的 淀粉样纤维 的 构象稳定性及 蛋白酶 K 酶解抗性 的 特征。结果表明大分子拥挤环境显著促进了人朊蛋白 的 淀粉样纤维化 的成核期 ，在人朊蛋白错误折叠及其病理性进程中有着重要作用。然而 高浓度 大分子拥挤 试剂 对于兔朊蛋白的纤维化聚集则表现出抑制的效果。通过 对 大分子拥挤环境中 朊蛋白突变体的研究，初步实验结果表明连接朊蛋白结构域中 上的氨基酸残基 可能 对于兔免于 染因子感染 起着较为关键的作用。 上述研究为了解朊 蛋白在类细胞的大分子拥挤环境中错误折叠 的 行为提供了 重要信息，为阐明兔能抵抗 染因子侵染 的 原因提供 了 一定线索，为 据。 I 大分子拥挤环境中朊蛋白错误折叠机制研究 博士生：周拯 导师：梁毅 教授 （武汉大学生命科学学院结构生物学实验室，武汉 430072，中国） 中文摘要 蛋白质是生物体最重要的组成成分，一旦蛋白质形成了错误的空间结构，直接导致其生物学功能的丧失或改变，继而引起众多相关疾病 ， 迄今已发现有二十多种蛋白质的错误折叠与疾病相关 。 传染性海绵样脑病 （ 即 所谓 病 （ 是一类 慢性 的 、可在多种哺乳动物之间广泛传播的致死性中枢神经系统疾病。兔是少数几种对 胞型朊蛋白错误折叠 形成 致病型朊蛋白发生在拥挤的细胞外膜环境中，而致病型朊蛋白是引起 关键感染因子。本文以人朊蛋白、兔朊蛋白及 它们的 突变体 蛋白 为研究对象，利用多糖拥挤试剂 模拟拥挤的细胞外膜 环境，运用生物物理学手段，研究 了 模拟生理环境中两种 朊蛋白错误折叠与聚集的动力学和二级结构变化规律， 并 观察其形成淀粉样纤维程度及形态的差别， 进而 探讨细胞外膜生理环境在人 /兔朊蛋白错误折叠中的促进 /抑制作用 及其内在机制 。 第一部分的实验结果表明大分子拥挤试剂显著促进了人朊蛋白淀粉样纤维的形成。利用 合得到 的 成核延滞期 时间 与延伸期的表观速率常数表明 ：类 细胞 的 大 分子拥挤环境对人朊蛋白 淀粉样纤维化过程的成核期有显著的促进 作用 。此外，大分子拥挤环境使得人朊蛋白形成更短的纤维及颗粒，且相对稀溶液中形成的纤维具用更弱的结构稳定性和更强 的蛋白酶 K 抗性。以上种种表明， 一方面 大分子拥挤环境加速了 人朊蛋白 错误折叠纤维化的进程；另一方面 ，大分子拥挤环境促进了人朊蛋白纤维的片段化 并改变了纤维的构象稳定性 及酶解抗性 ，这可能对于朊病毒感染及复制 有重要 意义。 对于兔朊蛋白的淀粉样纤维化过程，大分子拥挤 环境 则表现出不一样的影响。低浓度大分子拥挤试剂 的 存在对于兔朊蛋白淀粉样纤维生长有一定程度的促进，但随 大分子 拥挤试剂浓度进一步升高，兔朊蛋白淀粉样纤维的形成受到显著制。以透射电镜观察不同浓度 大分子 拥挤试剂存在条件下兔朊蛋白纤维化可以发现，高浓度的大分子拥挤试 剂将兔朊蛋白淀粉样纤维 生长 的进程停滞于类似于寡聚体或 原纤维 的阶段，从而抑制了淀粉样纤维的进一步生长。 在此基础上，我们比对了人与兔朊蛋白一级结构序列，根据相关文献确定了可能影响纤维化过程的关键 氨基酸残基 ，利用分子生物学方法突变并表达得到了人及兔的相关位点突变 体 蛋白质。进而研究了这些突变体在稀溶液及大分子拥挤试剂存在条件下淀粉样纤维形成过程。 初步的 实验结果表明兔朊蛋白三点突变（ 137I/在稀溶液中的纤维化动力学与野生型相近，但大分子拥挤试剂 的 存在显著缩短了延滞期并促进了延伸速率；而人朊 蛋白突变体（ 138L/随着突变位点的增加，其在稀溶液中淀粉样纤维形成的延滞期显著增长，但最终平台都能达到相近的 ，大分子拥挤试剂存在时同样在一定程度上促进了淀粉样纤维的形成，但对于延滞期和延伸速率的促进作用相对于野生型则相对较低。以透射电子显微镜观察人或兔朊蛋白突变体淀粉样纤维的形态可以发现 ， 相对于野生型朊蛋白，其形态学并没有发生显著变化。由目前的结果可以推测，兔朊蛋白在 引入 上述三个位点的突变 后 可能引发其转向类似于人朊蛋白的错误折叠方向 ，而人朊蛋白的对应突变体 则 只 在一定程度上 延迟了纤维化进程， 仅此三个位点的突变并不能逆转 大分子拥挤试剂对 人朊蛋白的纤维化进程 的影响 。 关键词：传染性海绵 样 脑病、朊蛋白、淀粉样纤维、大分子拥挤、错误折叠 h. D i (30072, o of in of we of in hT UV we by A to of of of a in as as in be on on in in to in a an in of by is to be an in we of in of We in of a by of of EM FM V in by in or We 137I/138L/ of no to of of of is in of a to i 目录 中文摘要 . I . 1 章 前言 . 1 白质构象病 . 1 病 . 3 蛋白概述 . 3 . 7 . 9 蛋白错误折叠与神经退行性疾病 . 13 白质淀粉样纤维相关研究方法 . 15 外淀粉样纤维形成的条件 . 15 粉样纤维形成的经典检测方法 . 17 粉样纤维形成的其它研究手段 . 19 白质淀粉样纤维动力学模型及数据拟合 . 20 分子拥挤 . 22 分子拥挤概念及排斥容积理论 . 22 分子拥挤条件下蛋白质淀粉样纤维的研究 . 25 题的研究内 容及意义 . 26 第 2 章 大分子拥挤环境中朊蛋白淀粉样纤维形成的研究 . 30 要 . 30 言 . 31 验材料与仪器 . 31 验材料 . 31 要仪器 . 32 验方法 . 32 蛋白的原核表达复性及纯化（柱上复性法） . 32 蛋白的原核表达复性及纯化（ 相柱分离法） . 35 蛋白淀粉样纤维的生长及检测 . 38 验结果 . 43 蛋白纯化结果 . 43 分子拥挤试剂对人朊蛋白淀粉样纤维生长的影响 . 44 分子拥挤试剂对人朊蛋白淀粉样纤维形态学的影响 . 55 分子拥挤试剂对人朊蛋白淀粉样纤维结构稳定 性的影响 . 56 分子拥挤试剂对人朊蛋白淀粉样纤维 解抗性的影响 . 58 变性条件下人朊蛋白淀粉样纤维化初步研究 . 59 分子拥挤试剂对兔朊蛋白淀粉样纤维生长的影响 . 61 分子拥挤试剂对兔朊蛋白淀粉样纤维形态学影响 . 63 朊蛋白与兔朊蛋白种子相互诱导淀粉样纤维生长的研究 . 66 论 . 68 第 3 章 大分子拥挤环境中朊蛋白突变体淀粉样纤维形成的研究 . 76 要 . 76 言 . 76 验材料与仪器 . 77 验材料及试剂 . 77 要仪器 . 78 验方法 . 79 /兔朊蛋白定点突变 . 79 /兔朊蛋白突变体的表达纯化 . 80 /兔朊蛋白突变体淀粉样纤维的生长及检测 . 80 验结果 . 80 分子拥挤试剂对人朊蛋白突变体淀粉样纤维形成的影响 . 80 分子拥挤试剂对兔朊蛋白突变体淀粉样纤维形成的影响 . 83 论 . 85 参考文献 . 88 攻读博士学位期间发表的论文目录 . 104 致谢 . 105 1 第 1章 前言 白质构象病 蛋白质是细胞组分中含量最为丰富、功能最多的 大 分子物质，在生命活动过程中起着各种 生命功能执行者的作用，几乎没有一种生命活动能离开蛋白质，因此没有蛋白质就没有生命。细胞内星罗棋布的蛋白质网络是确保细胞、组织行使正常功能的关键。而作为蛋白质网络单元的蛋白质都具有自身独特的三维构象，由氨基酸序列决定的三维结构是蛋白质功能的基础。具有完整一级结构的多肽链只有当其折叠形成正确的三维空间结构才能具有正常的生物学功能。细胞内大多数天然蛋白质能自发的形成比较稳定的天然构象，或被配体和代谢因子所稳定；约 1020%新生肽链需要分子伴侣 （ 的帮助才能正确折叠；另外，约有 20%新生肽链不能形 成正确的三维构象而被蛋白酶降解 （ et 1999） ，其中包括由于错误转录和翻译形成的不完全蛋白质，翻译后受到化学损伤或其他因素引起的失活、去折叠或错误折叠的蛋白质 （ 2003） 。因此，在大多数情形下蛋白质错误折叠可以避免，而少部分的错误折叠蛋白亦可由蛋白酶降解清除。由分子伴侣、蛋白酶体等组成的蛋白质质量控制体系指导新生肽链形成正确的功能性天然构象，避免了绝大部分错误折叠的发生，同时能够降解清除小部分错误折叠蛋白，保证了细胞的正常运作 （ 2005） 。然而，越来越多的研究表明仍有部分逃逸于质量控制体系 之外 的错误折叠蛋白质（ 及其累积形成的聚集体 （ 成为多种神经及系统性疾病的致病原因 （ et 2008, 2003） 。这些所谓的蛋白质构象病 （ 包 括了 大部分常见的神经退行性疾病以及某些罕见的家族遗传性疾病，它们共同的特征在于均有蛋白质的沉积的发生 （ 见表 1。神经退行性 疾病通常对人的抽象思维、运动、情感、认2 知及记忆等方面造成严重影响。最主要的神经退行性疾病包括阿尔兹海默氏症（ s 、帕金森症 （ s 、亨廷顿舞蹈症 （ s 、传染性海绵样脑病 （ 以及肌萎缩侧索硬化症 （ 等 （ 2003, 1999,1993,1998, 2004, 2003） 。目前 ，对于 这些神经退行性疾病的致病性研究还未发现 存在有 共同的分子机制，然而尽管 这些疾病 具有不同的临床症状及发病进程，却 亦 具有某些共同的特点：大多数神经退行性疾病多发生 于 高龄人群，且兼有散发性与遗传性，其病理学特征多为神经元缺失及神经突触异常 （ 见表 1。蛋白质构象病的显著特征在于都会有相关联的某个特殊蛋白质错误折叠成某种异常的构象并导致聚集进而在组织中积累形成 淀粉样纤维状的沉积。这些沉积物质具有相似的形态学、结构及染色性质，而其生化及生理特征则不尽相同，某些沉积定位 于 细胞质，而另一些则可能定位 于 细胞外或细胞核。淀粉样沉淀这一术语最初即是用来描述在阿尔兹海默氏症病患中发现的胞外蛋白质沉淀，现在淀粉样沉淀泛指以通常具备刚果红染色、 光及抗蛋白酶降解等特征，电镜观察表现为杆状纤维。 表 1见蛋白质 构象 病及相关蛋白质 s 2 I 3 of s s 1要神经退行性疾病相关信息 名称 相关蛋白质 聚集体细胞定位 阿尔兹海默氏症 散发性 （ 95%） 遗传性 （ 5%） 胞外 /细胞质 帕金森症 散发性 胞质 亨廷顿舞蹈症 遗传性 胞核 肌萎缩侧索硬化症 散发性 （ 90%） 遗传性 （ 10%） 胞质 传染性海绵样脑病 散发性 （ 90%） 遗传性 （ 8%） 感染性 （ 2%） 胞外 病 蛋白概述 于 词，意为蛋白质感染因子。 病是一类遗传性、感染性、散发性并存的人畜共患的神经退行性疾病。牛海绵样脑病 （ 、羊瘙痒症 （ of 以及人克雅氏综合症 （ 等人畜致死性疾病均属于病 （ et 2007） 。朊病毒是只由异常的朊蛋白 （ of 组成而不含有核酸的蛋白质感染性因子，而细胞内正常的朊蛋白 （ of 在一定条件下可能在翻译后通过4 某些因子的诱导使其转变为致病性的 一过程包括部分 结构的变化直接导致其物理化学性质随之发生 显著变化 （ 1998, et 2006） 。 表 1朊蛋白疾病及其病因 人 病种类 致病原 因 家族遗传性 克雅氏综合症 （ 遗传性特定位点的 因突变 合症 （ 家族致死性失眠症 （ 感染性 过部落的食人习俗感染 过医疗途径感染 过食用 患动物感染 散发性 内异常的 因突变 或自发产生的 象转变 码朊蛋白的基因 于人体内的第 20 号染色体短臂，在小鼠体内定位于第 2 号染色体。该基因是一个单拷贝管家基因。根据 哺乳动物不同种属间初始转录子结构的差 异， 以分为两大类：第一类由三个外显子框和两个内含子框组成，如牛、羊、小鼠等；第二类由两个外显子框和一个内含子框 。如仓鼠、人等。在第二类 内含子序列中仍然有第一类外显子类似区。 端上游 1.5 区域中可能包含了 调控 序列。 表达具有明显的组织特异性，这种特异性在胚胎发育早期就已表现，在这一时期该蛋白只在中枢神经系统以及外周神经系统、牙床、后肾帽延伸 物、胎盘等组织中表达；在成年动物体中该蛋白在神经细胞中大量表达 。 对 29 种哺乳动物以及九种鸟类的研究发现：在所有这些动物中均存在 且在这些动物体内朊蛋白柔性区的序列很保守。进一步的研究5 发现 仅存在于哺乳动物、鸟类及酵母中 ， 而且在海生哺乳类动物、有袋类动物等几乎所有脊椎动物中均存在，因此推测朊蛋白在脊椎动物中的功能可能比较保守。近来有研究者发现在水生生物以及细菌中也存在这一基因，只是其同源性与脊椎类动物相差较大。 目前研究已经发现，超过 25 种 因的突变体与人遗传性 病相关 （ 图 1， 它们 体 能够引发 一系列 致死性神经疾病 ， 如人克 雅氏综合症 （ 、合症 （ 以及致死性家族失眠症 （ 等 （ 1999） 。这些突变体大致可分为两类： 1） 引起朊蛋白氨基酸突变的单点突变或 多 点突变，以及表达截短朊蛋白片段的中止突变； 2） 在野生型朊蛋白五个八肽重复序列区域随机插入额外的编码八肽重复序列的基因。 由于朊蛋白构象的变化 是 导致疾病的根本原因，因此 目前 最迫切的工作在于了解这些疾病相关的突变体如何能有利于促进 变 。 早有研究发现八肽重复序列并非 需 ，且并不位于具有蛋白酶 K 抗性的感染性 的 这一 看似多余的八肽重复序列如何影响 这一区域确实对于 图 1朊蛋白疾病相关病理性突变位点 6 朊病毒 的 致病机理 目前 得到 最普遍 认同的是由 先提出并由述明确的“ 说 （ et 1998） 。该假说认为朊病毒是神经元细胞外表面正常存在的朊蛋白 异构体。在组织器官中引入病理性构象的朊病毒将导致 按照这一假说可以预测缺失了 验表明由同源重组产生的 失小鼠 （ o） 表 型 正常。用鼠朊病毒感染， 失小鼠能够完全免疫，且在脑、脾脏中也没有发现朊病毒的聚集 （ et 1993, et 1993） 。尽管“ 说的证据还不充分，许多研究者都认 同 即使朊蛋白不是唯一的致病因子，它也是最为关键的致病因子。围绕“ 说开展的研究逐步揭示出朊蛋白在 病中的关键作用，并不断发现 有 一系列细胞因子参与了朊病毒的复制过程 （ et 1997, et 1999） 。这些细胞因子 的功能 可分为两类，其一能稳定 二可能帮助 不参与 患有羊瘙痒症的病羊脑部分离纯化的朊蛋白中即发现有多聚糖的存在， 研究发现 约有 515%的 常认为这些多糖在结构上起着脚手架的功能，它们帮助 蛋白酶的降解 并 使之在细胞内稳定存在。此外， 在 有发现 神经鞘脂类及胆固醇 的 存在 。经过近 20 年的研究， 却 仍没有证据表明核酸在朊病毒感染性或宿主特异性中有所作为。 然而， 有研究发现核酸可能在外研究发现 子有利于 而这种促进作用似乎与 子聚阴离子的性质相关，而非特异的序列依赖性 （ et 2003） 。糖胺聚糖 （ 属于另一种聚阴离子， 它也具有 促进 作用 （ et 2002, et 2002） 。聚阴离子可能与 N 端区域 带正电的氨基酸残基 相互作用， N 端区域 虽然7 并不直接参与抗蛋白酶 K 的 富含 却可能对这一过程 有 着重要 影响 。 朊病毒 “株系” （ 的存在是 “ 假说最难解释的障碍之一，研究发现从不同种属分离得到的感染性物质感染实验动物有着明显的潜伏期长短、神经中枢系统分布以及 解释这一问题，目前主要的工作集中于研究不同物 种 朊蛋白形成的 异 （ 2005, et 2004） ，利用傅里叶变换红外光谱能够发现 层结构之外的细微差别 （ et 2009） ，这可能意味着 不同物种形成 因此造成了 异源朊病毒之间 感染潜伏期的延长 的现象 。 常的细胞型朊蛋白 中枢神经系统和淋巴组织以及神经肌肉接触处表达，通常认为其在铜离子代谢及信号转导过程中有重要作用。核糖体新合成的含 253 个氨基酸 的 肽链 在 切去 N 端 （ 1的信号肽序列 后 ，定位 于 糙面内质网并在此糖基化 174 与 214 之间形成链内二硫键，接着切除 C 端信号肽 （ 231并锚定 在运输至细胞膜的过程中穿过高尔基体并进一步完成糖基化修饰 。 最终形成的 端区域与一个含有 3 个 个短的 括 N 端信号肽， 5 个富含脯氨酸和甘氨酸的八肽重复序列， 1 个高度保守的中部疏水区和 1个含有糖磷脂酰肌醇 （ 的 C 端疏水区。 定在细胞膜上。值得指出的是在 第129 位残基是一个多态性位点， 这个位点的 差异 与 对 染的敏感性密切相关 （ et 1998, et 2004） 。 8 图 1然目前研究还未深入，但仍发现正常型朊蛋白 细胞内行使多种生理功能。朊蛋白含有 的 特殊的八肽重复序列能 特异结合铜离子 ， 从而 能够 调节淋巴细胞、神经细胞的铜离子浓度。 有铜离子结合作用，在体内可以 属蛋白的形式存在，因此 能起着富集铜离子或调节细胞内铜离子浓度的作用 （ 1999, et 2003, et 2002） 。 活性有关，有研究发现缺失或仅保留一个八肽重复区的小鼠性，而带有两个八肽重复区时即可增强 性。 圆二色及红外 光谱学研究表明 含 3%的 2%的 。 蛋白 的致病 形式， 是二级结构发生显著变化 （ 3%， 0%） （ et 1993） 。 抗蛋白酶水解的核心区，不 易 溶于变性剂。 起蛋白质淀粉样病 变 。 蛋白酶 K 降解的聚积物而引起疾病。据此，朊蛋白在 病 中既是致病蛋白又是感染因子，这 便 可解释并追溯这类疾病的传染性、遗传性和散发性起源。在散发性和遗传性 病的 发生中，认为最初发生自身的 后再以 9 表 1构体形式 正常 病理 45% 30% 3% 45%