高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究

高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究 答辩人 ：李 文石峰田 实验方案v通过改变培养基中激素的浓度、配比和糖浓度等对蝴蝶兰顶芽、花梗节间等外植体进行组织培养快速繁殖试管苗，培育出愈伤组织诱导频率高、再生频率高的植株体系。v蝴蝶兰组织培养成功后，我们将用秋水仙素对其进行处理，培育多倍体蝴蝶兰 。技术路线母株选择 初代诱导 丛芽分化 继代增殖 壮苗生根 锻炼幼苗 出瓶移栽 实验方案表格如下图所示：MS（加 Vc,椰汁） NAA (mg/l) 6-BA(mg/l) (1) (2) (1) (2)花梗 节间 4 4花粉 块 1 1 5 5幼叶 1 1 20 20茎尖 1 1 5 5根尖 10 10V W（加 Vc,椰汁） NAA (mg/l) 6-BA(mg/l) (1) (2) (1) (2)花梗 节间 4 4花粉 块 1 1 5 5幼叶 1 1 20 20茎尖 1 1 5 5根尖 10 10项目研究进展情况(08-3-12-08-4-4)总进度： 正在进行愈伤组织的诱导，观察，分离和筛选阶段。分进度：v第一阶段： 召开开题报告会，小组讨论会议，确定实验如何开展。第二阶段：相关文献、资料的搜集，培养基的选择实验材料的挑选。v 第三阶段： 母液、培养基的配制、灭菌、倒板，材料的预处理（ 4 ,24h）、购买。无毒处理、接种。v第四阶段： 接种外植体后进行培养（ 25 ，黑暗培养），观察，记录褐变、污染情况，并设计相应的解决方案。v 第五阶段： 吸取经验，重复实验，进行新方法的测试与应用。进展结果v茎尖和根尖很容易长霉，而花粉块和花梗节间很少被污染。褐化的外植体也基本是茎尖和根尖，因为这些外植体细胞分裂比较活跃，多酚氧化酶的活性也相对要高些，因此容易褐化。v部分外植体褐变、霉变，其余外植体形态、颜色与接种前相比无明显变化目前存在的问题v 问题一：霉变 消毒不彻底。 超净工作台操作不严格。 无菌操作意识不足。 封装保存不完善。v 问题二：褐变 外植体切割后，内部细胞与外界空气直接接触，组织中多酚氧化酶被激活，多酚类化合物和单宁被氧化后产生醌类物质的缘故。 切割面过大，外植体被损伤。 接种方向不对，应使切割面接触培养基。 外植体过于老化。 初代培养中培养基中无机盐和植物生长调节物质浓度过高。v问题三：材料来源 长沙无蝴蝶兰培养基地，市场上销售的蝴蝶兰为观赏用花，不能作为理想的实验材料，因此接种后脱分化、再分化的效果不好。解决方案 v 增强无菌操作的意识v 活性炭能有效控制褐化和促进生长 , 但不利于分化 ; 谷胱甘肽控制褐化的效果虽不及活性炭 , 但综合效果最佳。因此可在培养基中加入这些抗氧化物质，以防止外植体的褐化。 v 选择幼嫩的实验材料，有利于外植体脱分化及愈伤组织的诱导。v 总结上次实验经验，确定合适的无机盐、琼脂和植物生长调节物质的浓度。下阶段计划及主要措施 v 计划： 总结经验后，决定用花梗节间和花粉块两种外植体继续培养、诱导愈伤组织，并控制培养条件，如加入活性碳等，以防止褐化。 利用蝴蝶兰种子培育出蝴蝶兰试管苗，此试管苗幼嫩，可作为理想的实验材料进行组织培养。 措施：v 第一步： 搜集蝴蝶兰种子培养基的相关文献资料，了解其萌发条件，萌发周期，萌发所需培养基。v 第二步： 利用种子培养基对种子接种，并添加一些生长调节物，如香蕉汁等，探索缩短种子萌发的因素。v 第三步： 待种子萌发后，按规范的组织培养操作方法，进行外植体的接种。v 第四步： 所用外植体为 3 4片叶试管苗的顶部两片叶。将叶片切成约 1 cm见方接种于不同的培养基上 , 每次处理 10瓶 , 每瓶接种 4块 , 叶片正面向上。培养室温度 (25 1) , 光照强度约 1 500 lx (光源为 40W日光灯 ) , 光照时间 12 h /d。v 第五步： 待叶片表面出现芽点状突起时 , 制作常规石蜡切片 , 切片厚度 8m, 番红、固绿染色 , 光学显微镜下拍照。接种后 50 d统计胚状体或愈伤组织发生情况。形成率 =形成胚状体块数 /接种外植体总块数。预期成果 v 一 通过向培养基中加入活性碳等抗氧化剂，防止外植体褐化。选择激素的最适浓度配比，添加适宜的生长调节物，如椰汁等，培养出愈伤组织诱导频率高，再生频率高的植株体系，达到加快繁殖速度的效果，使蝴蝶兰繁殖成本降低，以提高经济效益。v 二 由蝴蝶兰种子萌发的蝴蝶兰试管苗，取其幼叶为外植体（该外植体幼嫩，是理想的实验材料），进行组织培养，以期获得再生频率高的植株体系。v 三 将无菌操作贯穿在整个实验过程中 ,尽量防止外植体的霉变、褐变、染菌 ,提高实验的成功率。v 四 用秋水仙素处理再生的植株体系 ,以期得到目前未报道，具更高观赏价值的多倍体蝴蝶兰。第二阶段进展报告(08-5-12)v用三个品种的蝴蝶兰种子培养 ,得到三种蝴蝶兰无菌试管苗 .v(1)其幼叶因为幼嫩 ,可作为下一阶段的外植体,进行愈伤组织的诱导 ,并继续探索提高蝴蝶兰离体培养成功率的条件 .v(2)可直接用秋水仙素处理无菌试管苗 ,得到多倍体蝴蝶兰 ,探索其观赏价值 ,遗传学特征等 .蝴蝶兰种子培养出的试管苗第二阶段小结v完成情况 :2,3号种子有根萌发 ,接着萌发出嫩黄色的幼叶 .而且叶的颜色渐渐转变成绿色 .根毛特别发达 ,可能和其吸收水分和养料有关 .v存在问题 :1号种子目前仍无萌发现象 .1号种子最大 ,可能是因为接种前 1号种子的浸泡时间不够 ,所以其萌发也较缓慢 .第二阶段小结v