聚合酶链反应检测ApoE基因型的研究

1、维普资讯 740-l聚合酶链反应检测 ApoE基因型的研究湖北医科大学第二临床学院医学检验系(武汉 4071)堡茎 哈黛文贺小玲 吕 民摘 要 奉文以人工台成韵具有 3末端错配韵寡核苷酸引物 ，进行聚合酶链反应【p：jyI瑚chanreaction，PCR)，检测 104份健康成人血脱辅基脂蛋白E(印0lip。p E，ApoE) ，共检出5种常见的 AVoE基医型 ，以 ApoE33型最多 ，占总教的 712 ，等位基因颠率分布以 (08465)最高。PcR法的摸板 DNA取自血白细胞，与常规的等电聚焦电泳(is钟】舵 h ing，正F)比较，36份健康成

2、人血样品同时用两种方法作 ApoE分型 ，结果基本一致。对比分析，PCR法检测 Ap 基因型，具有快速灵敏及特异性高等优点。主墨词动脉粥样硬类健康的疾病之病因，载脂蛋白的量及质的异常与高脂血症，尤其是遗传性高脂血症密切相关。脂蛋白中的 ApoE具有 多态性，检测其多态性对高脂血症引起的 AS疾患如冠 心病、脑梗塞及痴呆症的早期诊断有一定的临床意义。为此，检测ApoE多态性方法学研究越来越被人们所重视。人 ApoE表 型的检测方法很多文献已有报道_1“J。本文以聚合酶链反应技术从基因方面进行分型，并与常规的等电聚焦电泳(IEF)技术从蛋白质方面分型加以比较，现报道如下。材 料 与 方 法一、对象

3、：健康成人 104例经有关体格检查，无心血管及脂代谢有关的痰患血清胆固醇总量低于57tmnolL、甘油三脂低于 17mmolL。男性 60 倒，女性 44例，年龄 3674岁 ，平均年龄 53 岁。二、方法：1模板 DNA提取：空腹 12h后，静脉或末梢采全血 05ml，EDTANa)抗凝，用低渗溶血剂(10nmlLTrisHCA，pH80，05mmolLMgCh)溶解破坏红细胞，多次沉淀洗涤白细胞，除2DNA扩增：体外扩增引物参照文献 5设计的 5种引物 ，可编码 ApoE等位基因 299个氨基酸残基的 EXON4区。5种引物 D、E、F、G和H的寡核苷酸系列分别是：引物(D)3GcTcCG

4、GCGGACCACGTCAT5，(E)3AcIcGGccGAcCAcGrcAT 5， (F) 3OCTGACcC1EA CATGGTCCG 5，(G)3Ac】 ACCGTCA CATGGqCG 5，(H)5AAGGACT1B从 GGC凹-AcAAAT3，其中引物 H为公共引物，分别与引物 D、E、F和 G配对扩增聚合形成 的产物是145bp、l45bp、277bp和 277bp。引物由中科院上海生化所合成。反应体系：总体积 5o ，其中 10T DNA 聚台酶缓冲液 5vl、15mmoLL Mgcl2及 2mmalL dNTP各 5to每管有引物 H及分别含 D、E、F和 G各 5Omol、

5、酶 2单 位(Pr0喵B公司)，模板 DNA05一1om。热循环温度 94 45s， 60oC 45s，70 90s，循环 35次。再 72 5min。在基因扩增仪(黑马 480)上进行。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测。3聚合酶链反应(PCR)法确认 ApoE基因型的依据：按文献 j报道 ，Ap0E由 19号染色体维普资讯 上的同一基因位点的三个等位基因即 E2、 和编码形成常见的 3种主要 异构体 E2、E3和E4，致使 ApoE多肽链上 112位和 158位氨基酸残基不同，其差别在于，E2异构体在上述两位点均为半胱氨酸 (Cys)；E3异构

6、体在 112位为 c ，158位为精氨酸(A职)；FA异构体两位点均为 A取。这种差异使 ApoE出现 3种纯台子和 3种杂台子的 6种表型。确认一份样品的表型需进行 4次反应，引物 D决 定 112位 A瑁，产生145bp产物；引物 E决定 112位 Cys产生 l45bp 产物；引物 F决定 158位 AJg产生 277bp产物 ，引物 G决定 158位 Arg，产生 277bp产物，详见表 J。产物寡核苷酸分子量确认按文献L9报道方法进行操作。表 1 ASO 引物确定 Ap0E基因型的依据Table 1 Basis ofApoE genotype identhied uASO 一rs*A

7、lelespecifcdigonucleJde；EachASOprimerwesusedto 母 -,vitho monH4ApoE表型的 IEF检测法：ApoE蛋白质组份的提取，按王克勤法_6进行。IEF法，以5聚丙烯酰胺凝胶为支持物，按文献 报道方法进行分型。 将 36份样品除作 PCR法检测基因型外，又同时用 IEF法进行分型 ，以比较两种分型方法的符合率。5斑点杂交：DNA片段收集，在紫外灯下，将已确认的 Apo2型的 G引物扩增产物277bp片段切下取出 。采用 IS(D 电泳装置的DNA收集槽，按说明书的常规收集 D1NA，尔后，再经电泳确认。斑点杂交，以 G引物扩增产物的 277

8、bp段为探针，用洋地黄毒苷法标记(BMB)探针，方法按说明书操作。对 Apo3和 E32型经 皿F法无法确认的样品作鉴定，以判明是否有 G引物扩增产物的存在。6统计：遗传频率按 Maxhtam Iikehhood法计算。结果一、 PCR法基 因分型的 ApoE基 因型：PCR扩增产物电泳结果如图 1、2所示。经一|毽菇算奎函璺。墅墨壁璺fl1of agamd n H曲 p日I咖forApoE 啊pe 山clEbyPcRwith-山一scdi Inlc晰 dep*(一)POl；(+)腿is脚* *DG，0fH丑m r。学withoutelocuIlIl0 BG iI| 0fPCR pI n is

9、 咖,#houteloc ，Io BM：DNA m*测量计算，4种扩增产物分子量分别为 145bp围 l基因型的姐742 和 277bp两类 ，共检测 104份样 品，检出 5种基因型，未检出 Aport4型，其中 ApoE33型 74例，占 712；ApoE43型 l3例 ，占 125 ；ApoE32型 l5例，占 144；ApoE22型 1例，占 O95；ApoE42型 1例 ，占 095。00m一】t5晰 Ilasidw6 t冲eEt2-Fig 2 Result 0f agarmed魄m】pIl0 s sep删 iol|forA0or I0byPCR，methodwithalele*f一

10、(+)M：图 2胶电泳结果二、IEF法豹 ApoE分型 ：36份样品同时用 PCR法和 IEF法检测0E表型，检测结果如表 2所示。其中 1份样品经 IEF法定为 ApoE32型 ，经 PCR法捡查为Alxfl33型，用斑点杂交确认，该样品无 G引物扩增产物，故定为 ApoE33型 ，其余 35份样 品两法分型结果一致。三、ApoE基因频率分布：经统计，按 PCR法 ，依 104例检测结果 为准，其基因频率分布是，E2、e3和 E4分 别为00863、08465、00672。讨论维普资讯 衰 2 FCR法和 IEF法检测 A呻E多奋性结果 比较Table

11、2 Q 叨pa 9Dn deol|forA0or isofromusl the PCR and IEF metimdsmlj卿一 l蹋一 3 Tr k：36种 擗时型m，-按其基因分型称为 ApoE基 因型，二者检测脚墨结撒果一应该是一致的 ApoE基因型分型是采用PCR娲一法 基于引物的特异性，能与 EXON4区结合，进而合成 ApoE各异构体的基 因片段，其结果是可靠的。引物设计时，据 Blair报道L ，有意将 E和 G引物碱基系列中的 G错配为 T(引物系列标上 号)，其非特异性扩增产物减少，作者检测操作结果确是如此，仅一条特异的目的 DNA产物出现。ApoE表型的确认，公认的常规方法

12、是 IEF 法，需要超速离心且费时。然而 PCR法较为简便易行。据本文两方法比较，PCR法值得推荐。【EF法是从基因表达产物蛋白质水平进行分型，操作过程中，蛋白质的分离纯化，电泳染色以及扫描定量等环节易导致 IEF法 的误差，PCR法分型却不存在这方面的问题。本文所测样品全部重复 1次 ，以确保结果的准确性，两者比较，PCR法作双份检测比 IEF法容易进行。PCR法扩增时，偶尔会出现非特异性扩增带，只要特定位置有或无目的 DNA产物往往 并不影响 ApoE的定型分析。PCR法确认的 ApoE基因型与陈保生报道j的结果基本一致，与本文作者曾经报道的结果也基本一致 J。参 考 文 献l WeL,W

13、aber KH， Rail SC， Mahley RW，ela1Ha-lI heterogenicity cy ineinteredlaI目esin the m ino athd seuence of apoE isofonm J BiolChnn，1981，256：90772 z sV1，BIe吐( ILHI蚰蛳州 loademitylipolxotein)0Iip0pE isoproteinpolymohism iseO m,d byApoE多态性按其蛋白分型称为 Apor表if,merle variation and pommmlafiatmlm0d6c ol|Bio-chemiy，19

14、81，20：10333 Utermann G，Kincrmmm I，Kafarink H，etal ApofilmpteJnEpheI10yp andhyperlipidemiaHum G ，1984t652324 陈保生，乔家治，乔彩莲，等 载脂蛋白 E等位基因频率的种旗差异中国人群与西方人群的比较 中国医学科学皖学报，1987，9：3985 EhirFM PeterJH，Jc瞄，d a1 ApDlip0pr0Iem Eyp g using theyImni lin reaeliqland alele specific mde de p n 幅 J“pid Res，1991，32：蝎6 王克

15、勤何锦麟 一次性密度梯度超速离心分离维普资讯 743血清 VI)L，LDL，toirmL3发无 脂血清 生物 化学杂志，1986，2：157 WaatelMR，Suckling PA，J部 Ils E1)Genetic variation inlLn aP p0pEJClin，1982，23：11748 周 新 甘佩珍，杨香久等 健康人与 型糖尿病人 Al砌E遗传表壁武汉大 学学报 1990生物工程专刊。1099 刷 新 吴翠华王望梅，等 P(m 技术在人乳头瘤病毒 611型检 铡中的应用研究，实用医学检验杂志1994，1：33(1996年 1月 17日收

16、璃，1996年9月 26日修回)A methodologicalstudy forapolipoprotein E genotype usinghet polymerase chain reactionZhouXinTuJianCheng，HaDaiWen，HeXiaoLing，h Min丑Laborato，TheSecondClbucalCdlegofndiMedical，Wum(430071)Abstract PhenpingApoEw studiedbvpolymerasechainreaction(PCR)Syntheticalele(specifcoligonucleofidepri

17、mers)withbasepairmisanatchedat3一terminalto脚ApoE genefltgn：lenlweIeusedinthismethod104healthynormoipidadultswefcdetected(total5 types)ItwaBfound thatApoE3 w712，and3，thehight alelefmquea distribution(O8465)ThetpleteDNA used【0呻 I w鼬isolated from humanwhiteblood ceApoE phenopesweredetected with both IEF

18、(isoelectrofoeusing)andPER ni 36 healthy adultsData obtained with hesetwollelhodst acrded with each other，butin comparisonwith IEF，hePCRt raethodm 1TIDIesensilive，specifc andmpjd，lesII ApolipoprotelnGenotypeAlleles(上接第 745页)用大肠杆菌经静脉感染动物，或以结肠穿孔制作感染性休克动物模型，早期心输出量增加，外周血符阻力下降；至晚期心功能进一步下降心输出量下降，其血流动力学改变与人类外科感染性休克十分桐似m 咖 删 用大肠杆菌内毒索攻击猪 心脏 态学改变最早发生于受攻击后 18h。本文表明：MC与大肠扦菌对心脏影响有差别，前者更易引起心肌