核酸化学课件.ppt

1、第二章 核 酸 (Nucleic Acid),主要介绍碱基、核苷、核苷酸和核酸的结构、性质和功能，核酸的分离、提纯、鉴定等。,一 核酸的概念,核酸英文名nucleic acid（NA）,1868年瑞士F. Miescher（米歇尔）发现了核酸。,第一节 核酸的概念和及生物学意义,核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间结构的大分子化合物。,二 核酸的分类、分布和生物学功能,核酸分为两大类. 脱氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid。,DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。 DNA为双

2、链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。,脱氧核糖核酸（DNA）,DNA,双链线状,双链环状,单链线状：动物病毒MVM,单链环状：噬菌体X174,真核细胞染色体DNA,噬菌体T2，T5，T7，P22,E-Coli染色体DNA,线粒体DNA,叶绿体DNA,多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA,噬菌体和X174的复制型,DNA的生物功能,DNA是主要的遗传物质,基因：是指在染色体上占有一定位置的遗传单位。 基因有三个基本属性： 可通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代； 经转录对表型有一定的效应； 可突变形成各种等位基因。 DNA具有基因的所有属性，基因也就是DNA的一个片段。,19

3、44年Avery细菌转化实验,转化作用：,转化作用的物质称转化因子,从一种细菌中得到DNA通过一定途径进入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改变。, 噬菌体感染实验,1952年美国Hershey 噬菌体感染实验,DNA与遗传性疾病、癌变的关系,（1）镰刀状红细胞贫血病的DNA点突变,（2）白化病的基因缺失,（3）癌变,核糖核酸（RNA）,RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。,RNA的类别,根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种。,其它类别的RNA,（1）病毒RNA（Viral RNA, rRNA）,（2）核内RNA（nucl

4、ear RNA, nRNA）, 不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA）, 小分子核RNA（small nuclear RNA, sn RNA）, 小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA）, 染色体RNA（chromosomal RNA, ch RNA）,（3）线粒体RNA（mitochondrial RNA, mit RNA）,（4）叶绿体RNA（chloroplast RNA, chlRNA或ctRNA）,mRNA (信使RNA),约占总RNA的5%。 不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。 它的功能是将DNA

5、的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核糖核蛋白体。,Messenger RNA,tRNA (转移RNA),约占总RNA的10-15%。 它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。 RNA分子的大小很相似，链长一般在73-78个核苷酸之间。,Transfer RNA,rRNA (核糖体RNA),约占全部RNA的80%， 是核糖核蛋白体的主要组成部分。 rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关。,Ribosome RNA,原核生物核糖体,70S,50S,30S,5S rRNA， 23S rRNA,34种蛋白质,16S rRN

6、A,21种蛋白质,真核生物核糖体,80S,60S,40S,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,49种蛋白质,18SrRNA,33种蛋白质,RNA的生物功能,1RNA与蛋白质的生物合成,（1）mRNA与遗传密码,（2）tRNA的作用,接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照mRNA上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。,（3）rRNA的作用,具有核酶活性，能够催化肽键形成，起装配和催化作用,第二节 核酸的组成,一 碱基（base）：又称含氮碱,（1）嘧啶碱（pyrimidine, Py）,（2）嘌呤碱（purine, Pu）,其它嘌呤（核酸的代谢产物）：,黄嘌呤、次黄嘌呤、

7、尿酸等,（3）修饰碱基（modified base）： 也称稀有碱基（minor base）,（一）核苷（nucleoside）,1核苷的结构,核苷：含N苷，-苷,二、核苷、核苷酸,核苷中戊糖与碱基的连接方式：,腺嘌呤核苷 （adenosine）,胞嘧啶脱氧核苷 （deoxycytidne）,核苷,核糖核苷（核苷）：A、G、C、U,脱氧核糖核苷（脱氧核苷）：dA、dG、dC、dT,命名，简写符号,天然核苷：一般为反式构象,2修饰核苷（modified nucleoside）： 也称稀有核苷（minor nucleoside）,修饰核苷包括三种情况:,（1）由修饰碱基和糖组成的核苷,（2）由非修

8、饰碱基和2-O-甲基核糖组成的核苷,（3）由碱基与糖连接方式特殊的核苷,（1）,（2）,（3）,(),修饰核苷的简写符号,少数修饰核苷用单字符号如D、I；但大多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基。,取代基用下列小写英文字母表示 :,注意：,例: 2-O-甲基腺苷 Am,含修饰核糖的核苷即2-O-甲基核苷的表示方法，在核苷符号的右下方注上一个小写m。,（二）核苷酸（nucleotide, Nt）,1核苷酸的结构,（1）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）：,2，3，5一核糖核苷酸,(2-AMP),(3-AMP),(5-AMP),

9、3，5一脱氧核糖核苷酸,Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP),Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP),（2）脱氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：,（三）核苷酸的衍生物,ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。它的结构如下：,（1） ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),ATP的性质,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。 ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。,cA

10、MP 和 cGMP,cAMP(3,5- 环腺嘌呤核苷一磷酸)和 cGMP( 3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。,胞内,ATP cAMP + PPi,磷酸二酯酶,5-AMP,腺苷酸环化酶 （AC）,（一）DNA的一级结构Primary structure即DNA的共价结构,1DNA分子中核苷酸的连接方式,第三节 核酸的分子结构,包括DNA的结构、RNA的结构,。,RNA,简写方法：线条式、文字式,在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱基的种类和顺序，所以上式可以进一步简化为： 5PAPCPGPCPTPGPTPA 3 或5 ACGCTGTA 3,在DNA一级结构中

11、，有一种回文结构的特殊序列，所谓回文结构即DNA互补链上一段反向重复顺序，正读和反读意义相同，经反折可形成“十字形”结构，在转录成RNA后可形成“发夹”样结构，有调控意义。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA ,1提出DNA双螺旋结构模型的根据,（2）x-光衍射分析,（二）DNA的二级结构,（1）已知核酸化学结构和核苷酸键长键角的数据,（3）DNA碱基组成的定量分析,20世纪40年代chargaff规则, DNA碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。, A=T；G=C；A+G=T+C ；A+C=T+G ；,2DNA双螺

12、旋结构模型（double-helical structure）,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构。,DNA双螺旋结构要点：,1两条反向平行的多核苷酸链形成右手螺旋。一条链为5 3，另一条为3 5。（某些病毒的DNA是单链分子ssDNA） 2碱基在双螺旋内侧，A与T，G与C配对，A与T形成两个氢键，G与C形成三个氢键。糖基-磷酸基骨架在外侧。表面有一条大沟和一小沟。 3螺距为3.4 nm，含10个碱基对（bp），相邻碱基对平面间的距离为0.34 nm。螺旋直径为2 nm。 氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆积力维持螺旋的纵向稳定。,4

13、碱基在一条链上的排列顺序不受限制。遗传信息由碱基序所携带。 5DNA构象有多态性。,稳定DNA双螺旋结构的化学键,（1）互补碱基对之间的氢键,（2）碱基堆积力（base-stacking forces）：碱基有规律的堆积， 使碱基之间发生缔合，形成了碱基堆积力，由碱基的电子之间 的碱基相互作用而产生的。,（3）磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键 生理pH条件下DNA带有大量的负电荷，吸引着各种阳离子，组蛋白、 Na+、K+ 、Mg2+ 等，形成了离子键，消除了自身因带负电荷而产生 的斥力，增加了DNA的稳定性。,3DNA双螺旋的种类,Watson Crick DNA双螺旋结构（B

14、型DNA）,当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时， DNA的构象发生改变。,不同DNA纤维的空间结构,A-DNA：,与B-DNA相同处：,与B-DNA不同点 :,（1）螺体宽而短，直径2.55nm；11个核苷酸一圈，螺距2.46nm。,（2）碱基的倾角大一些：倾角19。,A-DNA：RNA分子中的双螺旋区；DNA-RNA杂交分子。,A-DNA和B-DNA之间可以相互转换，推测在转录时，DNA分子发生BA的转变。,反向的两条多核苷酸链，右手螺旋。,4DNA双螺旋的研究进展,（1）Z-DNA,1979年美国ARich等人发现了左旋DNA（左手DNA双螺旋结构）,Z-DNA特点： 两条多核苷酸绕

15、成一个左手螺旋； 糖磷酸骨架链的走向呈“Z”字形，因此被称为Z-DNA； 分子外表只有一道沟槽（大沟消失,小沟加深）； 碱基对在分子轴外侧，并构成分子的凸面； DNA双螺旋体比较细长。,概括：,A型螺旋比较粗短，碱基倾角大一些，大沟深度明显超过小沟； B型比较适中； Z型细长，大沟平坦，核苷酸构象顺反相间，使磷酸和糖骨架呈Z字形。,DNA二级结构还存在三股螺旋DNA，三股螺旋DNA中通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合，第三股的碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对。 三股螺旋中的第三股可以来自分子间，也可以来自分子内。 三股螺

16、旋DNA存在于基因调控区和其他重要区域，因此具有重要生理意义。,（2）三螺旋DNA,（2）三螺旋DNA,A（T）*A T;G（C）*G C H-DNA,（三）DNA的三级结构,DNA三级结构是指DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构。 生物体内有些DNA是以双链环状DNA形式存在，如有些病毒DNA，某些噬菌体DNA，细菌染色体与细菌中质粒DNA，真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA都是环状的。 环状DNA分子可以是共价闭合环，即环上没有缺口，也可以是缺口环，环上有一个或多个缺口。,在DNA双螺旋结构基础上，共价闭合环DNA（covalentlyclose circular DNA）可以进一步扭

17、曲形成超螺旋形（super helical form）。根据螺旋的方向可分为正超螺旋和负超螺旋。正超螺旋使双螺旋结构更紧密，双螺旋圈数增加，而负超螺旋可以减少双螺旋的圈数。几乎所有天然DNA中都存在负超螺旋结构。,一段双螺旋圈数为10的B-DNA连接成环形时，不发生进一步扭曲，称松弛环形DNA（双螺旋的圈数=链绕数，即T=L，超螺旋数W=0；L=T+W），但将这一线形DNA的螺旋先拧松一圈再连接成环时，解链环形DNA存在的扭曲张力，可导致双链环形成负超螺旋（T10，L=9，W = -1）。 L为连环数；T为扭转数；W为超螺旋数。 L=T+W 比连环差： (L-L0)/L0 在生物体内，绝大多数

18、超螺旋DNA以负超螺旋的形式存在，也就是说，一旦超螺旋解开，则会形成解链环形DNA，有利于DNA复制或转录。 螺旋具有相同的结构，但L值不同的分子称为拓扑异构体。DNA拓扑异构酶切断一条链或两条链，拓扑异构体可以相互转变。L值必定是整数。,（四）真核生物染色体,真核细胞DNA是线形分子，与组蛋白结合，其两端固定也形成超螺旋结构。DNA被紧密地包装成染色体来自三个水平的折叠：核小体、30nm纤丝和放射环。 核小体是染色体的基本结构单位，是DNA包装的第一步，它由DNA结合到组蛋白上形成复合物，在电镜下显示为成串的“念珠”状。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质，其氨基酸序列在进化中是高度保守的

19、。组蛋白有5种，H2A、H2B、H3和H4各两分子组成的八聚体是核小体核心颗粒，DNA缠绕其上，相邻核小体间的DNA称为连接DNA且结合H1。压缩比约为7 。 30nm纤丝是第二级压缩，每圈含6个核小体，压缩比是6。 30nm螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒，压缩比是40。 再进一步形成染色单体，总压缩近一万倍。典型人体细胞的DNA理论长度应是180 cm，被包装在46个5m的染色体中。,RNA通常以单链形式存在，比DNA分子小得多，由数十个至数千个核苷酸组成。RNA链可以回折且通过A与U，G与C配对形成局部的双螺旋，不能配对的碱基则形成环状突起，这种短的双螺旋区和环称为发夹结构。 RNA的C2位羟基

20、是游离的，是一个易发生不良反应的位置，它使RNA的化学性质不如DNA稳定，能较DNA产生更多的修饰组分。RNA的种类、大小、结构都比DNA多样化，按照功能的不同和结构的特点，RNA主要分为tRNA、rRNA和mRNA三类。 此外，细胞的不同部位还存在着另一些小分子RNA，如核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞质小RNA（scRNA）等，分别参与mRNA的前体（hnRNA）和rRNA的转运和加工过程。,RNA的结构,几类RNA的结构,（1） tRNA的结构：分子量最小的RNA，约占总RNA的15%。主要功能是在蛋白质生物合成过程中，起着转运氨基酸的作用。,1965年Hol

21、ley等测定了酵母丙氨酸tRNA的一级结构，并提出二级结构模型。,1.一级结构特点：核苷酸残基数在7395；含有较多的稀有碱基（如mG、DHU等）；5-末端多为pG，3- 末端都是-CCA。,2tRNA的二级结构为“三叶草”形，包括4个螺旋区、3个环及一个附加叉。各部分的结构都和它的功能有关。5端17位与近3端6772位形成的双螺旋区称氨基酸臂，似“叶柄”，3端有共同的-CCA-OH结构，用于连接该RNA转运的氨基酸。3个环是二氢尿嘧啶环（D环）、反密码子环、TC环。,319731975年S.H.Kim的X射线衍射分析表明，tRNA的三级结构呈倒L字母形，反密码环和氨基酸臂分别位于倒L的两端,

22、tRNA的二级结构,（1）aa接受臂（amino acid arm）,（2）二氢尿嘧啶环 （dihydrouridine loop, DHU loop）,（3）反密码环（anticodon loop）,（4）额外环（extra loop）,（5）TC环（TC loop）,1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸，沉降常数3S，缺少D环和D臂，呈二叶草型。,近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。,1约占细胞总RNA的80%。主要功能是与多种蛋白质组成核糖体，是蛋白质合成的场所。 2核糖体在结构上可分离为大小两个亚基。原核细胞的rRNA有3种，23S与5S rRNA在大

23、亚基，16S在小亚基。真核细胞有4种rRNA，其中大亚基含28S、5.8S、5S，小亚基只有18S。 3. 各种rRNA的一级结构中的核苷酸残基数及其顺序都不相同，且有特定的二级结构。,rRNA的结构,原核生物的mRNA特点： 原核生物以操纵子作为转录单位，产生多顺反子mRNA，即一条mRNA链上有多个编码区，5和3 端各有一段非翻译区（UTR），无修饰碱基。,（3）mRNA的一级结构,真核生物mRNA的一级结构可用下式表示 :,5-cap：m7G(5)pppNmp,5-cap,cap0: m7G(5)pppNp,cap1: m7G(5)pppNmpNp,cap2: m7G(5)pppNmpN

24、mpNp,5-cap的功能,(1) 防止mRNA被核酸酶降解。,(2) 为mRNA翻译活性所必需。,(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。,3-polyA : polyA的残基数20200个，或更多。,polyA的功能,(1) 保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。,(2) 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。,(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。,DNA和RNA中的糖苷键与磷酸酯键都能用化学法和酶法水解。 并且碱基和核糖之间的糖苷键更易被水解，其中嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定。 在很低pH条件下DNA和RNA都会发生磷酸二酯键水解。 在高pH时，RNA的磷酸酯键易被水解

25、，而DNA的磷酸酯键不易被水解。,第四节 核酸的物理化学性质,一、核酸的水解酸碱水解,2-核苷酸3-核苷酸 混合物,包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。,（一）核酸水解酶的分类,1底物：核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）,脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）,2作用方式：核酸内切酶（endonuclease）,3按磷酸二酯键断裂的方式,4其它：如双链酶、单链酶等,核酸外切酶（exonuclease）,（二）核糖核酸酶类,1牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease, 简称RNase A或RNase I）,2核糖核酸酶T1（rib

26、onuclease T1，简称RNase T1）,3核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，简称RNase T2）,主要作用点为Ap残基，水解速度AUGC,（三）脱氧核糖核酸酶,1牛胰脱氧核糖核酸酶 （pancreatic deoxyribonuclease简称DNase I）,2牛脾脱氧核糖核酸酶 （spleen deoxyribonuclease, 简称DNase II）,3限制性内切酶（restriction endonuclease） 简称限制酶,限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起了保护作用。,（1）限制性内切酶的特征, 具有严格的碱基专一性，有专一的识别

27、顺序、切点, 粘性未端，平末端,（2）限制性内切酶的命名,EcoRI 属名（第一个字母）、种名（前两个字母）、菌株、编号,（3）限制性内切酶举例,（1）一般物理性质： DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。常用乙醇从溶液中沉淀核酸。,（2）两性解离：碱基（嘌呤、嘧啶化合物杂环中的N） 磷酸的解离 DNA的酸碱变性使酸碱滴定曲线不可逆,二、核酸的物理化学性质,（3）紫外吸收性质,胞嘧啶核苷酸的解离,核苷酸的两性解离和等电点,碱基的紫外吸收,由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。,紫外分光光

28、度法,首先根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度,纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）,纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,或相当于20g/ml寡核苷酸。,摩尔磷消光系数（molar absorptivity）法,A：样品的光吸收值,C：每升溶液中磷的摩尔数,L：光径,在pH7.0时；DNA的 为6600, RNA的 为77007800。,：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数,

29、知道了磷的含量就可知核酸的含量,增色效应与减色效应,增色效应（hyperchromic effect）：核苷酸以及单链多核苷酸的 值比双螺旋结构的多核苷酸的 值要高，所以核酸发生变性时， 升高，此现象称为增色效应。,减色效应（hypochromic effect）： DNA复性后， 又 降低，这种现象称减色效应,（四）核酸的变性、复性和杂交,1变性（denaturation）,核酸变性的概念,引起核酸变性的因素,（1）热变性,结构：螺旋线团,理化性质：紫外吸收 粘度比旋光度,生物活性：生物活性或丧失,（2）熔点（Tm）,Tm: 熔点，熔解温度， 变性温度，解链温度 DNA热变性过程中，紫外吸收

30、值增高，有一个特征性曲线称熔解曲线，通常将熔解曲线的中点，即紫外吸收值达到最大值50%时的温度称为解链温度，又叫熔点（Tm）。,（3）影响Tm值的因素, DNA的均一性, DNA中G-C对的含量,经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44, 盐离子强度,2复性（renaturation）,（1）复性,理化性质: 比旋光度 粘度,复性 也称退火,生物活性得到部分恢复,（2）影响复性的因素, DNA的浓度, DNA片段的大小,温度,DNA的组成特点,Cot :,时的Cot值，即指复性完成一半时的Cot值。,C0：t=0时，起始DNA的浓度（mol/L）,C：t时间时，单链DNA的浓度（mo

31、l/L）,复性快慢由 来表示。,Cot :,3杂交（hybridization）,核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过 碱基互补形成双螺旋结构。,单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）,利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。,单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA）,单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）,用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交,1975年英国E. M. Southern首创的Southern blotting（Southern印迹）,原理,方法,探针：作为检测用的已知DNA序列或RNA序列的片段,1977年G.K.Stark首创Northern

32、blotting （Northern印迹）,Western blotting（Western 印迹）,第五节 核酸的分离、纯化和核苷酸的制备,（一）核酸的分离、提取通则,为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点 :,1保持低温（04）。,2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。,3防止核酸酶的作用。,抑制DNase：,可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。,抑制RNase：,（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate, DEPC）处理。,（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异

33、硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。,（二）大分子DNA的提取,1材料的选择,2细胞破碎 1.机械法：根据固体剪切作用分：珠磨法，压榨法 根据液体剪切作用分：高压匀浆法，超声破碎法 2.非机械法：干燥法 溶胞作用：酶溶解法，化学渗透法，物理法（渗透压法，反复冻融法）,3DNA-蛋白质（DNP）的提取,真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。,可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。,相 对 溶 解 度,NaCl（mo

34、l/L）,DNP在NaCl中的溶解度,4去蛋白质,（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1,5沉淀DNA,6去杂质,（1）去RNA,（2）去多糖,7进一步纯化,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纤维状DNA,较纯DNA,纯DNA,*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。,破细胞,1.0mol/L NaCl*,去蛋白质,酒精沉淀,去RNA,柱层析，电泳,密度梯度离心,去多糖,（四）核酸纯度鉴定,1.A260/A280,2.电泳,（五）核酸含量的测定,1.定磷法：钼蓝比色法,2.定糖法：,3.紫外吸收法,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,核酸的构象和分离,：超螺旋DNA环状DNA线状DNA蛋白质,DNA 沉降,（六