血红蛋白电泳的意义和判断PPT参考幻灯片.ppt

1、ADULT AND NEWBORN Hemoglobin screening with capillarys,1,2,目的,血红蛋白结构和功能的回顾 Sebia CAPILLARYS 2 / Minicap血红蛋白检测说明 血红蛋白临床结果说明,3,血红蛋白的结构,血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.,Normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.,三维结构,4 亚单位 2 alpha链 2 alpha genes 3 非 alpha链 : beta, delta,

2、gamma 1 b gene , 1 d gene , 2 g genes,4,正常结果,Hb A: a2b2,Hb F: a2g2,Hb A2:a2d2,+,-,琼脂糖凝胶 Hydrasys (Sebia) 碱性缓冲液,成人,新生儿,5,血红蛋白遗传病类型(HEMOGLOBINOPATHIES) ?,血红蛋白疾病 血红蛋白性质变化 : 血红蛋白分子病 结构异常, 一个或数个氨基酸变异或缺失, 都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变 常见血红蛋白变异体 b-globin : S C DPunjab E 血红蛋白含量变化 : 地中海贫血 合成或合成调控异常 : b globin b Thalass

3、emias a globin a Thalassemias 合并型 : 血红蛋白分子病Hemoglobinopathies /地贫 Thalassemias,6,血红蛋白遗传病,遗传性疾病基因学图谱,正常基因,异常基因,7,异常血红蛋白类型,目前, 已经证实的有超过1000 种以上的变异体(a, b, g and d) 大部分变异体出现频率较低, 并且没有明显临床症状 4种主要变异体 (Hb S, Hb C, Hb E and Hb DPunjab)出现频率较高 ( 特定人群) 携带者会出现健康问题 儿童可能在出生时即伴随有严重症状,8,血红蛋白疾病的区域分布图,Thalassemias,9,

4、常见与地中海区域: 意大利, 西班牙,希腊, 近东地区, 非洲北部. 同样常见于东南亚 : 泰国,印度, 越南,中国, 印尼. 临床症状 * Beta 地贫重症型 - 严重贫血 (需要长期输血治疗) * Beta 地贫中间型 * Beta 地贫轻微型 - 无临床症状,Beta 地中海贫血,常见区域,bo 没有Beta链合成 b+ 合成能力下降,10,Alpha 地中海贫血,临床症状: 根据Alpha基因的表达状态, 有4个不同程度的Alpha地贫症状 * 1 个基因表达沉默: 静止型 (非常难检测到, 在出生会测到Hb Barts 1-2% ) * 2 个基因表达沉默: 轻型alpha地贫,在

5、出生会测到Barts 2-10% * 3 个基因表达沉默: 血红蛋白Hb H病, 出生时出现2-30% Barts, 儿童-成人出现 10-15% Hb H * 4 个基因表达沉默: Hb Barts胎儿水肿综合征 (死胎),常见区域 常见与远东地区,非洲和地中海区国家,11,12,13,镰刀型红细胞血症,变异体出现在 6 GAG (谷氨酸) GTG (缬氨酸),14,C型血红蛋白分子病,变异体位置:AA 6: GAG (谷氨酸) AAG (Lys),Htrozygote composite,AC,SC,Chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,Homozygote,Chromos

6、omes 11,Htrozygote,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,Chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,SC heterozygote compound,Chromosomes 11,Heterozygote,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,d,b,d,b,A,g,A,g,G,g,G,g,15,D型血红蛋白分子病,常见区域: 常见于印度.,特点: 变异体位置 b121 Glu (谷氨酸,负电荷) Gln (谷氨酰胺, 不带电荷) (D- Los Angeles = D-Punjab) (6 di

7、fferent Hb D according to the position of the mutation) 碱性缓冲液中: 电荷下降 M电泳速度变度变慢,靠近Hb S,临床症状:,基因杂合体: 无症状 (仅在电泳中发现D区带) Hb A fraction: 65 70 % Hb D fraction: 30 35 %,基因纯合体: 轻微贫血 Hb A fraction: absence Hb D fraction: 100 %,16,E型血红蛋白分子病,常见区域: 常见与东南亚地区.,特点: 变异位点 b26 Glu (谷氨酸,负电荷) Lys (赖氨酸,正电荷) 碱性缓冲液: 总体带电荷

8、下降 凝胶电泳中,出现在HbC附近,临床症状:,杂合体: 无症状 Hb A fraction: 65 70 % Hb E fraction: 30 35 %,基因纯合体: 轻微贫血 Hb A fraction: absence Hb E fraction: 100 %,17,下列情况下,需要进行血红蛋白检测,临床和遗传问题 (产前诊断) 贫血,小红细胞症 新生儿筛查 对来自地贫高发区人口,进行筛查 对诊断有帮助的其他信息 患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景 (输血记录) 血液全套检测, 网状细胞级别和进行细胞形态镜检 Hb电泳 (EDTA抗凝管) 离子平衡和溶血情况,18,血红蛋白检测的

9、几种方法,目前, 血红蛋白检测步骤如下: - 电泳法对Hb进行检测 或者使用等电聚焦电泳法 - 使用 HPLC法进行确认.,19,20,凝胶电泳结果识别表,21,在pH梯度的凝胶片上, 根据蛋白不同的等电点,对蛋白进行分离 Hb电泳位置取决于缓冲液PH值 蛋白电泳至其等电点位置后,停止泳动 At pI=pH, Hb does not have a net charge and stops migrating 电泳分离效果好, 但时间长.需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断,等电聚焦电泳法,介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法: - 通过毛细管电泳法, 即可以获得与IEF方法一样的分辨率

10、,同时检测结果量值Hb A2/Hb F同样精确. - 出现异常变异体后: 使用下列方法确认: * ITANO test (solubility test) * HPLC液相色谱 * Genotyping基因筛查,22,Capillarys 2,Minicap,全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测 Capillarys 2 / Minicap,23,毛细管电泳法原理,24,此时,电渗力(EOF)远远强于电场力. 因此,蛋白被动从正极向负极端移动.,正电极 +,EOF,负电极 -,Electro migration,蛋白电泳,DETECTION,INJECTION,25,Capillarys/Min

11、icap血红蛋白电泳,血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程, 然后,在415nm紫外光下被检测并显示出来. 正常质控品 必须在每天检测前使用 Capillarys : - 检测速度: 40 样品/小时 试管架1 至 7号位放置样品, 8号位放 4ml溶血素 Minicap : - 检测速度: 10 样品/小时 试管架1 至 26号位放置样品, 27号位放溶血素(8个样品消耗5ml溶血素),26,Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求,抗凝管采血 (EDTA, heparin, citrate). 如果需要对输血患者采血, 需要在输血前采集血液. 使用去除血浆后

12、的红细胞(隔夜或5000 rpm,5分钟离心后样品) + 4C以上, 标本最多存放7天. 需要长期存放, 可以洗涤红细胞后,放置于 -80C (可存放至少 3个月),27,Capillarys Minicap 血红蛋白条带识别表,Capillarys/Minicap区带识别表,Z 15 : Hb H Z 14 : / Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore, J-Kaoshiung Z 12 : Hb Barts, Hb Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore. Z 11 : Hb Kaoshiung(New York),d

13、enaturated Hb A Z 10 : Hb Hope, Hb M-Iwate Z 9 : Hb A, Hb Camperdown, Hb Phnom Penh Z 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GA Z 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Allegre. Z 6 : Hb D-Punjab, Hb Philadelphia, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Kln,denaturated Hb E. Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handswo

14、rth, denaturated Hb O-Arab. Z 4 : Hb E, denaturated Hb C, Hb Kln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variants Z 3 : Hb A2, Hb O-Arab Z 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variant Z 1 : Hb dA2 Hb aA2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant,29,30,正常Hb A2 质控品,条带结果可录为QC,31,Hb AFSC质控品, 可用来作为参照曲线,

15、便于异常结果的判断,32,Hbs A, F,A2 检测结果可通过颜色进行区分,异常区带显示为灰色,主要异常血红蛋白变异体,Z15 Hb H Z12 Hb Bart Z10 Hb Hope Z9 Hb A Z7 Hb F Z6 Hb D Punjab Z5 Hb S Z4 Hb E Z3 Hb A2 Z2 Hb C,HbE,HbS,HbH,33,34,HbS 变异体, Hb A2 正常值 6 Glu Val,Hb A = 22,Hb S = 2S2,Hb A2 = 22,Capillarys/Minicap血红蛋白试剂优势:,无需前处理(不需要洗血和溶血)，直接检测 血红蛋白C和E能从A2分离开

16、 根据S型和D型的细微电荷区别, 进行区分. 对于处于A和S之间的F给予个性化和聚焦的精确量化. 对A2型血红蛋白有很好的分辨率和分离效果 Hb Barts 和 Hb H可以很好的检测和量化 糖化型血红蛋白电泳出现在主体峰内,不影响检测结果,35,36,异常结果分析,37,Case 2:31 Y Female, 血红蛋白 12.8, 红细胞压积 37.4 (I),A = 84.1 % F = 1.5% A2= 5.5%,38,31 Y Female, Hgb 12.8, Hematocrit 37.4 (II),Alk,Acid,F,S,C,A2,C,S,F,-thalassemia- 轻型,

17、A2,A,A,A,A,C,P,C,P,A=93.4%, F=1.1%, A2=5.5%,Hb A 92.5% Hb F 2.6 Hb A2 4.9%,Hb F,Hb A,Hb A2,67 Y female from Tunisia, Hgb 9.1, hematocrit 28, MCV 62,小红细胞症; beta thalassemia轻型,39,Hb H 4% Hb A 94.7% Hb A2 1.3%,Hb A,Hb A2,Hb H,Child 9 Y, from Laos, Hgb 8, hematocrit 27.9, MCV 54.1,严重小红细胞症; 血红蛋白H病，需要基因筛查

18、,40,41,Hb H and Barts - Alpha-thalassemia,H Barts,42,Case 1: 13 Y Male, Hgb 8.1, Hct 24.0 (I),A2= 6.1% S = 82.8 %,43,Case 1:13 Y Male, Hgb 8.1, Hematocrit 24.0 (II),Alk,Acid,F,S,C,S,A2 + F,C,S,F,S,Hgb F/S, A2=4.6% + beta thalassemia minor,A2,A,F,A,C,P,C,P,44,Case 2:65 Y Male, Hgb 9.4, Hematocrit 27.

19、3 (I),Co-migration with A2,A= 62.1 % A2 = 31.7%*,45,Case 2: Hb E Migrates Separately From Hb A226 GluLys,21Y, pregnant woman,Hgb 13.1, hematocrit 38.6,Hb A 95% Hb F 2.1% Hb A2 2.9%,Normal pattern, Hb F slightly increased (pregnancy),46,Baby 2 months old,father from Martinique, mother from Central Af

20、rica, Hgb 11, hematocrit 29.8,Hb F 49.5% Hb S 25.9% Hb A2 1.8% Hb C 22.8%,Hb F,Hb S,Hb A2,Hb C,SC compound heterozygoty,47,Diabetic patient, 54 Y, Hgb 14.5, hematocrit 43.5, MCV 88,HbA1c measurement (HPLC Tosoh),Hb A 54.7% Hb X 41.7% Hb A2 3.6%,Hb A,Hb A2,Hb X,Normal hemogram; compatible with hetero

21、zygote A/D; To be identified by genotyping,48,Hb A 51.8% Hb A2 2.9% Hb C 35.9%,Hb A,Hb A2,Hb C,Diabetic patient, 61 Y, Hgb 11.6, hematocrit 34.8, MCV 85,Slight anemia; compatible with heterozygote A/C To be identified by genotyping,49,Adopted child, 4 Y, originated from Haiti, Hgb 10.9, Hematocrit 3

22、1.3, MCV 76.9,Hb A 97.5% Hb A2 1.4% Hb X 1.1%,Hb A,Hb A2,Hb X,Slight anemia; heterozygous Delta mutation, asymptomatic,50,Diabetic patient, 73 Y, Hgb 10.2, hematocrit 30.8, MCV 87.3,Alpha chain mutation; genotyping confirmation: Hb Winnipeg a 75 Asp Tyr,Hb A- Wi,Hb A2-Wi,Hb A,Hb A2,51,Hb A 90.3% Hb

23、F 3.8% Hb A2 5.9%,Hb A,Hb F,Hb A2,Hb A 64% Hb S 33.1% Hb A2 2.9%,Hb A,Hb S,Hb A2,Hb A 2.2% Hb F 67.3% Hb S 29.1% Hb A2 1.4%,Hb A,Hb F,Hb S,Hb A2,Father: Beta thalassemia minor Mother: Heterozygote AS,Baby 2 months old: Association S - beta thalassemia,52,Hb Lepore on Minicap/Capillarys,N,Ac.,A0 + Le

24、pore,A1,Hb A2,Hb A,Hb F,Hb Lepore,AFSC control overlaying,53,Hb Lepore,b和d链重新组合形成. 在碱性缓冲液下电泳: 总体带电荷下降 电泳位置出现 在S型血红蛋白附近,基因杂合体: Hb Lepore fraction: 5 15 % Clinical signs of minor b thalassemia,基因纯合体: Hb Lepore fraction: about 30 % Clinical signs of homozygous b thalassemia,常见区域: Lepore (- Boston Washi

25、ngton): 常见于意大利人群; 同样常见于在罗马尼亚, 澳大利亚和墨西哥人群. 特点:,54,a47 AspHis,Hb Hasharon,Hb A,Hb A2,Hb F,Hb Hasharon,Hb Ha-A2,Hb O-Arab,b121 GluLys,Hb A2+ O-Arab,Hb F,Hb A,56,DIAGNOSTIC FLOW-CHART,57,A NEW FAST HEMOGLOBIN ELECTROPHORESIS METHOD FOR DRIED BLOOD SPOTS ON SEBIA CAPILLARYS AUTOMATED SYSTEM,58,现有的新生儿血红蛋白

26、筛查方法 (SCD),新生儿血红蛋白检测: * 等电聚焦 (IEF) * 高效离子交换液相色谱法 (CE-HPLC). 毛细管电泳方法可取代常规,操作复杂的等电聚焦方法,59,新生儿血红蛋白快速检测法,取血板,BSD600 全自动打孔器,全自动溶血, 样品稀释和检测,条码识别： 取血板条码样品稀释杯条码,使用纯净水洗脱样品,60,与IEF方法比较, 毛细管方法优势,对于常见异常血红蛋白变异体有100区分能力 (Hb S, C, D, E) 对其他非常见变异体有良好检测能力 对不同类型样品拥有相同检测能力：新生儿, 早产儿或者进行过输血患儿样品 全程检测溯源性: 取血板和样品稀释杯使用条码 高效

27、性(48个样品/小时), 576样品/天 4小时人机分离操作, 最多可进行3X192个样品检测 可选择使用与毛细管匹配的全自动打孔机, 完全自动化处理样品 无需人工进行样品转移, 避免交叉污染 该项目检测完全自动化: 从前处理到检测, 直到结果分析,全程无需人工干预.,61,使用标准取血板, 在室温下进行干燥. 干燥的取血板可在 2-8C下,保存1个月.,新生儿血红蛋白检测的样品要求,通过颜色区分正常及异常样品,正常血样 :with Hb F and Hb A(+ acetylated Hb F),异常血样,63,提供样品检测完整溯源性,通过样品 ID, 试剂杯和全自动打孔器的数据记录完成数据

28、交换,异常样品自动显示,64,电泳图谱说明 : * 检测到条带的位置, 图谱会自动定位 * 鼠标经过的区带位置, 会显示出该区带的所有可能出现的异常血红蛋白名称. (N1 to N13).,新生儿血红蛋白检测条带名称识别表,N 13 : Hb Barts N 12 : / N 11 : Hb Hope, Gamma chain variants, denatured Hb A N 10 : Hb A N 9 : Denatured Hb F N 8 : / N 7 : Hb F N 6 : / N 5 : Hb D-Punjab, Hb G-Philadelphia, Hb Korle-Bu

29、N 4 : Hb S, acetylated gamma chain variants N 3 : Hb E, Hb F-Ouled Rabah, gamma chain variants, Methemoglobin N 2 : Hb A2, Hb O-Arab, Hb F-Ouled Rabah, gamma chain variants N 1 : Hb C,66,正常血样,Birth: 19/01/06 Sample collection: 24/01/06 Term : 39 w. Weight : 3445 g,67,输血后检测结果,Birth: 29/01/06 Sample c

30、ollection: 01/02/06 Term : 38 w. Weight : 3100 g,68,F/S homozygote,Birth: 05/01/06 Sample collection: 08/01/06 Term : 37 w. Weight : 3490 g,Hb S,Hb F,Denatured Hb F,69,早产儿体内的F/S,Denatured Hb F,Hb F,Hb S,Birth: 20/02/06 Sample collection: 23/02/06 Term : 34 w. Weight : 1300 g,70,F/SC compound heteroz

31、ygote,Denatured Hb F,Hb F,Hb S,Hb C,Birth: 30/01/06 Sample collection: 02/02/06 Term : 40 w. Weight : 3900 g,71,F/AS heterozygote,Hb A,Hb F,Hb S,Birth: 16/12/06 Sample collection: 19/12/06 Term : 36 w. Weight : 2780g,72,F/C homozygote,Hb F,Hb C,Denatured Hb F,Birth: 20/12/05 Sample collection: 24/12

32、/05 Term: 39 w. Weight: 3160 g,73,F/AC heterozygote,Birth: 18/12/06 Sample collection: 21/12/06 Term: 40 w. Weight: 3035 g,74,F/AC in a premature newborn,Birth: 17/10/05 Sample collection: 20/10/05 Term: 30 w. Weight: 2330 g,75,F/AD heterozygote,Birth: 29/01/06 Sample collection: 31/01/06 Term: 37 w. Weight: 3280 g,76,F/E homozygote,Hb E,Hb F,Denatured Hb F,Birth: 10/11/06 Sample collection: 13/11/06 Term: 40 w. Weight: ?,77,F/AE heterozygote,