外植体的来源.ppt

1、,一、概念和意义,器官培养,第二节 茎尖的培养,分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。 茎尖分生组织培养主要是指对茎尖长度不超过0.lmm的茎尖进行培养，这种培养可获得无病毒植株。 普通茎尖培养是指对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。,茎尖培养的概念和意义,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,微繁技术的概念： 通过茎尖培养进行植物的快速无性繁殖在一些植物中已经成为一门成熟的技术而被应用。由于这一技术是在无菌条件下，且又是在一个非常小的范围内来大量进行繁殖的。因而，人们又把这种繁殖技术称之为微繁技术,普通茎尖培养与繁殖技术,器官培养,第二节 茎尖的培养,茎尖微

2、繁殖过程一般包括五个阶段:, 无菌培养的建立。 芽的增殖。 中间繁殖体的增殖。 诱导生根。 试管苗的移栽。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,1无菌培养的建立 (1) 外植体的制备,供试母株应生长旺盛、枝条健壮、无病。 应先将材料进行消毒。由于植物的种类及材料的来源不同，可采取不同的消毒方法。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,首先对材料进行流水清洗，干净后迅速加入75的酒精中漂洗几秒到十几秒钟；然后用0.1%的升汞或20倍的次氯酸钠液消毒。对于嫩茎的茎尖，消毒时间宜短（58min即可）。对于来自较老枝条上的顶尖和侧芽及有芽鳞片保护的芽消毒时间可长达81

3、2min。也可以在用75酒精消毒后，用两种消毒剂连续消毒。消毒后的材料用无菌水洗3次，后置于无菌条件下进行常规剥离。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,除茎尖组织外，一些植物的茎切段和一些鳞茎植物的鳞茎切块、块茎、球茎等还可以通过培养产生不定芽而进行繁殖。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,（2）培养基 目前用于快速繁殖的基本培养基很多。常用的有MS、B5、 White培养基等。木本植物多用B5培养基。 糖浓度，一般为 23，固化剂选用琼脂。 天然有机物：椰子汁有利于兰花的增殖。麦芽汁有利于柑橘属的分化，水解乳蛋白或水解酪蛋白则有助于许多植物不定芽和不定

4、胚的分化。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,生长调节剂： 生长素：用的最多的是NAA，其次是IAA。 细胞分裂素：如 6-BA、KT和玉米素，细胞分裂素在促进不定芽产生上效果显著。 赤霉素：往往有利于茎尖的伸长和成活，需要的浓度较低，一般为0.lmgL，浓度太高会产生不利影响。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,（3）培养条件 光：光照度在 10003 000lx，光周期实行连续16h光照、8h黑暗。在微繁培养中光照不是为了满足培养物光合作用的需要，而是用于植物形态建成的诱导。 温度：常用的培养温度在25左右。植物不同有时也采用较低或较高的温度，一般认

5、为恒温对生长有利。 湿度：在干燥季节还应注意培养室内湿度的管理，以防培养基内的水分散失过多而对培养不利。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,2芽的增殖 茎尖微繁主要通过顶芽、腋芽的形成和发展以及培养茎尖组织不定芽产生而使苗在数量上迅速增殖。 （l）顶芽和腋芽的发育: 顶芽和腋芽在微繁殖培养中都能被诱导发育，可以诱导出单一的苗或多个苗。原理：利用细胞分裂素来抑制植物原有的顶端优势,而使侧芽和顶芽能够共同生长。对于顶端优势的植物，通常采用切除顶芽和适当的增加细胞分裂素浓度两项措施来克服其顶端优势。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,二、茎尖培养的一般方法,第二节 茎尖的培养,器

6、官培养,第二节 茎尖的培养,（2）诱导不定芽的产生 1.不定芽由外植体直接产生，这类不定芽通常是从表皮细胞或表皮以下几层细胞产生的，有时带有少量的愈伤组织。 2.外植体诱导产生愈伤组织，愈伤组织上产生不定芽。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,这两种途径的首要条件就是外植体的细胞要进行脱分化，由分化状态的细胞回复到具有分裂能力的分生细胞。第二步由已经脱分化的细胞或新形成的愈伤组织细胞形成一些分生细胞团。这些细胞有时呈较有规律的排列。较大的细胞在外，愈向内细胞愈小，排列也愈紧密。细胞质浓厚，核相对较大，中心的一些细胞可以认为是分生组织，以后由这些分生组织形成器官原基，进一步发

7、育成不定芽。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,不通过愈伤组织直接形成不定芽的途径更优越一些，因为植物在脱分化形成愈伤组织中可能会出现一些变异。但直接形成的不定芽并不总能保持原品种的特性，有时在繁殖中还能出现严重的质量问题。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,二、茎尖培养的一般方法,观赏植物中有不少遗传学上的嵌合体。如一些带镶嵌色彩的叶子、花、带金边、银边的植物等，在通过不定芽繁殖时，再生植株就失去了这些富有观赏价值的特性。,器官培养,第二节 茎尖的培养,原球茎最初是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造。种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐增大，以后种皮的

8、一端破裂，膨大呈小圆锥体称做原球茎。 在兰科植物的组织培养中，常从茎尖和侧芽的组织培养中产生一些原球茎。原球茎本身可以增殖。,（3）原球茎的发育,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,3中间繁殖体的增殖 由第二阶段培养所产生的芽、苗和原球茎等，数量有限，这些培养的材料可称为中间繁殖体。为了进行快速繁殖，它们还需要进一步培养繁殖，使之越来越多，增殖使用的培养基对同一材料来说，每次几乎都是相同的。由于培养材料在最适宜的条件下培养，排除了其他生物的竞争，就能够按几何级数增殖。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,4.壮苗和生根 中间繁殖体增殖到一定数量后，就要将增殖

9、的嫩枝进行壮苗和生根，产生完整植株，以便移植。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,一般认为，矿质元素浓度高时有利于发展茎叶，较低时有利于生根，所以生根培养时一般选用无机盐浓度较低的培养基作为基本培养基。用无机盐浓度较高的培养基时，应稀释一定的倍数。如MS培养基，在生根、壮苗时，多采用12MS或14MS。 一般生根培养基中要完全去除或用很低的细胞分裂素。并加入适量的生长素，最常用的是NAA。一部分植物由于生长的嫩枝本身含有丰富的生长素，因此也可以在无生长素的培养基上生根。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,很多草本植物不定根的形成很容易，但木本一般较难，从

10、成年树上得到的材料生根更难。对于这类生根较困难的植物，可试用以下几种方法：先用高浓度（100gL左右）的生长素处理嫩茎几小时到一天，用无菌水冲洗后再接入到培养基中；如苹果、苹果砧木、梨等，可在生根培养基中加入适量的根皮苷或根皮酚以促进根的形成，浓度约为150mgL。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,在生根阶段，培养基中的糖浓度要降低到1.01.5，以促使植株增强自养能力，同时降低了培养基的渗透势，有利于完整植株的形成和生长； 另一方面应增加光强，达到33 0010 000lx。在这样的条件下，植物能较好的生长，对水分的胁迫和对疾病的抗性将有所增加，植株可能在强光照下表现出

11、生长延缓和较轻微的失绿，但事实证明，这样的幼苗，要比在低光强条件下的绿苗有较高的移植成活率。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,5试管苗的移植 （炼苗） 是将第四阶段形成的小植株转移到土壤的过程，也是微繁殖中最关键的一步。 第一，应保持小苗的水分供需平衡，试管中的小苗，因湿度大，茎叶表面防止水分散失的角质层等几乎全无，根系也不发达，移栽后除了根系周围有适宜的水分供给外，还特别应保持空间的空气湿度，减少叶面的蒸腾。原则是在小苗移出的初期，外部温度条件要接近于培养瓶内，以后逐步向自然状态过度。这一工作又叫炼苗。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,第二，要选择

12、适当的介质，关键是疏松通气和适宜的保水性，而且不滋生杂菌。常用的有蛭石、珍珠岩、粗砂、炉灰渣、锯木屑等，或将它们以一定比例混合应用，这些介质的选用要根据不同的植物种类而定。有些草本植物的无菌苗还可以直接移入保湿性良好的土壤中。 第三，要防止杂菌滋生，保持种植场内外干净。适当使用一些杀菌剂可以有效的保护幼苗，如百菌清、多菌灵、托布津等。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,第四，要注意光、温管理。试管苗移出后，尽量避免阳光直射，以强度较高的散射光为好，光线太强会使叶绿素受到破坏，叶片失绿，发黄或发白，使小苗成活迟缓。同时，过强的光刺激蒸腾加强。光照强度也可随移出时间的延长而增加

13、。试管苗移植后温度要适宜，喜温植物 花叶芋、花叶万年青、巴西铁树等，以26左右为宜；喜凉的植物如马铃薯、文竹、菊花等以1822为宜。温度过高，使蒸腾加强，并易滋生菌类；温度过低，幼苗生长迟缓，不易成活。,二、茎尖培养的一般方法,器官培养,第二节 茎尖的培养,除上面的措施之外，有时在试管苗移植之前先将培养容器的盖子打开或松动，使空气进入容器，待锻炼三四天后再移植，会得到好的结果。小苗移植后24周左右，即可长出根系和新叶，可逐渐通风锻炼，后将成活的幼苗移入田间。,二、茎尖培养的一般方法,三、影响茎尖培养微繁殖的因素,器官培养,第二节 茎尖的培养,1基因型 2外值体的大小 3供试植株的生理状态 4芽

14、在植株上的部位 5供试植株的年龄 6. 培养基 7. 褐变,器官培养,第二节 茎尖的培养,8. 玻璃化 9. 极性 10后生变化 11中间繁殖体的形态发生能力 12遗传稳定性,影响植物快繁的因素,植物快繁的目的是以尽可能高的效率生产试管苗，获得最大的经济效益。因此，在快繁时应使各种影响因素处于最适合快繁的状态。,主要影响因素：,外植体 培养基 培养条件 继代培养 移栽,一、外植体：,外植体的来源：最适的为茎尖、带芽茎段，也可以利用叶片、子叶、根段、花器官组织等。 外植体生理年龄：幼嫩组织分化能力更强。 外植体大小：不能太小，否则影响成活率。除非是用于脱毒苗的生产。,二、培养基：,基本培养基：MS培养基应用最为广泛。对于某些植物及生根阶段，以1/4或1/2MS较好。蔗糖和葡萄糖浓度为2-4%。生根时稍低。 植物生长调节剂：主要以细胞分裂素和生长素的配合使用，调节外植体的生长和分化。另外ABA、GA、CCC等也具有不同的作用。 培养基的物理特性：以固体培养较为普遍，也有采用液体培养，如兰花原球茎的增殖。,三、培养条件：,光照：1000-3000lx，阶段可增强。14-16h/天。 温度：与植物的原产地相应。一般为252。有时可进行高温或低温的预处理。