生物样品分析方法的基本要求.ppt

1、第四节 生物样品分析方法的基本要求 在测定生物样品中药物及其代谢物时，一般要在测定前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集。,一、常用品种的种类、采集和贮藏 生物样品包括各种体液和组织，常用是血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液。,（一）血样 血浆（plasma)和血清（serum)是最常用的生物样品。 测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。 一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。,1.取样： 供测定

2、的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。 动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。 对于病人，通常采取静脉血，有时根据血药浓度和分析方法灵敏度。也可用毛细管采血。,2.制备： 血浆的制备 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，上清液即为血浆。 肝素是一种含硫酸盐的粘多糖，常用其钠盐、钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白。一般lml的全血需加0.10.2mg的肝素，加入血样后立即轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免导致血细胞破裂。,血清的制备 血清是由血液中纤维蛋白原等影响下，引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，经

3、离心其量约为全血量的30一50。在室温高时，血凝过程进行得很快，宜在血凝后半小时内分离血清。当室温低时，血凝过程较慢，可将血液置37温度下加速血清析出。 血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。,全血也应加入抗凝剂混匀，防止凝血。对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据。由于全血的净化较血浆和血清麻烦，特别是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。,3.特点： 血样的采取量受到限制、间隔时间，采集方法：一般取1ml2m1。用注射器、毛细管或微量采血管采取。血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异。 采取血样后，应及时分离血浆或血清，并立即进行分析。如不能

4、立即测定时，应完全密塞后保存，短期冷藏（4），长期冷冻（-20）保存。,（二）唾液 唾液的采集应尽可能在刺激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集。 采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。分层后离心分离，取上清液作为药物浓度测定的样品。 可集中、单一部位采集。,唾液中含有粘蛋白，为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在4以下保存，解冻后搅匀后再用，否则会产生误差。 优点：可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集，采集时无痛苦无危险；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。,缺点： 唾液是各腺体分泌的的混合液体，其组成发生经时变动；因此，

5、唾液中的药物浓度与血浆中的游离型药物浓度相比就容易变动； 唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值(S/P)只有少数药物是恒定值； 有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比血浆浓度低得多，需要高灵敏度的分析方法才能检测； 对有些患者（如癫痛二昏迷）不能采集唾液样品。,（三）尿液 尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究。 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物（conjugates）等形式排出。 尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。,尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，也方便，但尿液浓度通常变化较大，应测定一定时间

6、内排入尿中药物的总量，这就需要测定在规定时间内的尿液体积及尿药浓度，时间尿以外的尿不可能推断全尿中药物的排泄浓度和药物总量。,测定尿中药物的总量时，将一定时间内（如8h;12h或24h等）排泄的尿液全部储存起来，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。采集的尿液时，需用量筒准确地测量储尿量，并做好记录。,缺点：尿液中药物浓度与血药浓度相关性差；受试者的肾功能正常与否直接影响药物排泄，因而肾功能不良者不宜采集尿样；婴儿的排尿时间难于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。 采集的尿样应立即侧定。若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯等，短

7、时冷藏；长时冷冻。,二 生物样品分析其前处理技术 主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。 样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出。,根据被测定药物的结构、理化性质及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。 87页图4-4大致反映了检测方法与样品前处理要求的相互关系。,（一）去除蛋白质目的： 可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度； 去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性

8、能，延长使用期限。,去除蛋白质方法： 1.加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙睛、甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:（1-3)时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用超速离心机（10000r/min )离心便可将析出的蛋白质完全沉淀。,2.加入中性盐 使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。 常用的中性盐：饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率高。,3.加入强酸 当pH低于蛋白质的等

9、电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。含药物血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质，取上清液作为样品。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。,4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CUS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。,5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。,（二）缀合物的

10、水解 尿中药物多数呈缀合状态。 含羟基、羧基、氨基和巯基的药物。可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物； 含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酸水解或酶水解的方法。,酸水解时，可加入适量的盐酸液。 对于遇酸及受热不稳定的药物，可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷酶一硫酸酯酶的混合酶。,（三）分离、纯化与浓集 1.液液提取法（liquid-liquid extraction; LLE)多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性

11、杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。,应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等。 对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大：沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。 提取时所用的有机溶剂要适量。一般有机相与水相（体液样品）容积比为1：1或2:1。,生物样品一般多在碱性下提取，多数药物是亲脂性的碱性物质，生物样品中的内源性物质多是酸性的。 当碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。,提取时于水相（体液样品）中加入有机溶剂后，一般只提取一次。如有必要

12、还须将第一次提取分离出的含药物有机相再用一定pH的水溶液反提取（back extraction），然后再从水相将药物提取到有机相。 液-液提取法的优点在于它的选择性，这是依赖于有机溶剂的选择。极性大的药物使用离子对试剂（ion pair reagent）的离子对提取法（ion pair extraction method）。,2.液-固提取法（liquid-solid extraction，LSE）也为一种柱色谱法。将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。,LS

13、E具有优点：LSE较少引入杂质；消除了LLE的主要缺陷乳化现象；提取效率高，可用少量生物样品进行分析；柱为可弃型，废弃物易从实验室移走；在最后洗脱中多数采用以水为主的溶剂系统，大大增加了安全性；最大的优点为处理样品速度快，并在室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。,常用于填充柱的担体大致分为两类： 1.亲水性的硅藻土，有机溶剂冲洗药物 2.疏水活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶，吸附亲酯性药物，然后用有机溶剂分离药物。,3.被测组分的浓集的方法： 末次提取时加入的提取液尽量少，然后直接测定。 氮气流吹干 减压法挥去溶剂,（四）化学衍生化 分离前将药物进行化学衍生化的目的是：使药物

14、变成具有能被分离的性质提高检测的灵敏度增强药物的稳定性；提高对光学异构体分离的能力等。 药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化。,1.GC中化学衍生化法 药物的化学衍生化前处理对GC十分必要，衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而使GC温度不必很高即可适合GC分析要求，主要的衍生化反应有烷基化（alkylations）、酰化（acylations）、硅烷化（silylations）等。其中以硅烷化用得最广泛。,常用的烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMA

15、H）等； 常用的酰化试剂：乙酸酐、丙酸酐等； 硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（咖CS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（IMTS）等。,具有光学异构体药物的分离也可采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。常用的不对称试剂有：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。,2. HPLC中化学衍生化法 衍生化的目的是为了提高药物检测灵敏度。 化学衍生化包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。,柱前衍生化分析前尽可能将药物进行精制后再衍生化。 柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的，所以可形成对

16、检测器具有高灵敏度的衍生物，从而提高了选择性。HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。,三、生物样品定量分析方法验证（一）特异性 证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物（二）标准曲线与线性范围 回归方程相关系数r0.9900。在线性范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。,（三）精密度与准确度 药典附录药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则规定考察3个浓度的精密度和准确度。 一般RSD应小于15%，在LOQ附近RSD应小于20%。,批内精密度：是同一次测定的精密度。所得RSD应争取达到5以内，但不能超10。 批间精密度：是不同次测定的精密度。所得RSD应控制在15以内。 回收率一般应在85%115%范围内，在LOD附近应在80%一120范围内。,（四）最低定量限 最低定量限LOQ至少能满足测定3 -5个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax的1/10一1/20时的药物浓度。（五）样品稳定性 在室温、冰冻和冻融条件下以及