洛铂抑制胃癌sgc_7901细胞增殖及其机制的初步研究_郑磊_W

1、 军事医学 2013 年 8 月 第 37 卷 第 8 期 Mil Med Sci，Vol 37，No 8，Aug，2013 611 洛铂抑制胃癌 SGC-7901 细胞增殖及其机制的初步研究 郑 磊，高立明，付占昭，康丽影，余宗艳，毕 然，马智慧 摘要 目的 观察洛铂对胃癌细胞 SGC-7901 细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法 将对数生长期的SGC-7901 细胞分对照组( 不加药物) 和实验组( 加入不同浓度洛铂) ，采用倒置显微镜观察不同浓度下细胞生长状态; MTT 法观察对细胞的增殖抑制; Western 印迹方法分析不同浓度洛铂对 SGC-7901 细胞内 Bcl-2 蛋白表

2、达水平的影响。结果 倒置显微镜下观察，洛铂能抑制细胞增殖，出现明显的凋亡学形态特征。MTT 法显示洛铂能抑制细胞增殖，并呈浓度及时间依赖关系。Western 印迹结果显示洛铂能使 SGC-7901 细胞 Bcl-2 蛋白表达水平下降。结论 洛铂能明显抑制胃癌 SGC-7901 细胞增殖，诱导凋亡，可能与调节 SGC-7901 细胞 Bcl-2 蛋白表达水平相关。 关键词 洛铂; 胃癌; SGC-7901 细胞; 细胞增殖; Bcl-2 中图分类号 735 2; 979 1 文献标志码 A 文章编号 1674-9960( 2013) 08-0609-04 DOI: 10 7644 / j iss

3、n 1674-9960 2013 08 011 Lobaplatin inhibition of gastric cancer SGC-7901 cells proliferation and a preliminary study of its mechanism ZHENG lei，GAO Li-ming* ，FU Zhan-zhao，KANG Li-ying，YU Zong-yan，BI an，MA Zhi-hui ( The First Hospital of Qinhuangdao，Qinhuangdao，Hebei 066000，China) * Corresponding aut

4、hor，Tel:E-mail: tshgaoliming sina com Abstract Objective To observe the effect of lobaplatin on the proliferation of gastric cancer cell SGC-7901 and to study the mechanism Methods SGC-7901 cells in the logarithmic phase were divided into negative control group ( without drugs) and expe

5、rimental group ( adding different concentrations of lobaplatin) The inverted microscope was used to observe cell growth at different concentrations MTT method was used to observe the inhibition of the gastric cancer cell prolifera- tion Western blot was used to detect the expression of Bcl-2 in SGC-

6、7901 cells that were treated by different concentrations of lobaplatin esults Lobaplatin inhibited cell proliferation in a concentration-and time-dependencty manner Western blot results showed that Bcl-2 protein level decreased after lobaplatin treatment Conclusion Lobaplatin could significantly inh

7、ibit gastric cancer SGC-7901 cell proliferation and induce apoptosis，possibly related to the regulation of Bcl-2 protein expression Key words lobaplatin; gastric cancer; SGC-7901 cells; cell proliferation; Bcl-2 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，据最新统计， 我国每年新发胃癌患者达 40 万人 达 30 万人。我国胃癌死亡率居高不下，占全部肿瘤死亡率1 /5，仅次于肺癌。化疗在胃癌的治疗中

8、占有重要地为乳腺癌、小 细胞肺癌和慢性粒细胞性白血病( CML) 。研究表明，除上述适应症以外，洛铂在复发性卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、淋巴瘤及 肿瘤等方面也初步显示出较好疗效，值得深入研究和试用3。位，但是胃癌的化疗至今未确定标准化疗方 案1。 因为洛铂对胃癌 SGC-7901 细胞的基础研究相关文洛铂( lobaplatin，LBP) 是第 3 代铂类药物，抗肿瘤效果与顺铂( DDP) 的作用相当或更好，毒性较 DDP 小而无交叉耐药2。SFDA 批准的洛铂适应症 作者简介 郑 磊，男，硕士研究生，研究方向: 消化道肿瘤治疗， Tel:E-mail: applebro

9、ther 163 com 作者单位 秦皇岛市第一医院，河北秦皇岛 066000 通讯作者 高立明，Tel:E-mail: tshgaoliming sina com 献较少，本研究选取 LBP 作用于人胃癌 SGC- 7901 细胞，目的是在基础水平初步探索其可能的作用机制， 从而为 LBP 是否可在胃癌化疗中的应用及提高化疗疗效提供相应的理论基础和实验依据。 1 材料与方法 1 1 材料 1. 1 1 细胞株 人胃癌SGC-7901 细胞株购买于中国医学科学院肿瘤细胞库。 1. 1 2 药物 洛铂冻干粉剂( LBP) 为海南长安国际制药有限公司产品。 1 1 3 试

10、剂 四甲基氮唑蓝( MTT) 、胰蛋白酶、 Bcl-2 及 -actin 抗体均为美国 Sigma 公司产品; 二 甲基亚砜( DMSO) 购自北京鼎国昌盛生物技术有限 公司; 辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥公司; PMI1640 培养基为 Gibco 公司产品; 10% 优级胎牛血清为杭州四季青产品。 1 1 4 仪器 CO2 电热恒温培养箱( 日本 SANYO 公司) ，倒置显微镜( 日本 OLYMPUS) ，酶标仪( 上海 科华公司) ，DYCP-31B 型电泳槽( 北京六一仪器 厂) ，DYY-2 型稳压稳流电泳仪( 美国 BD 公司) ， HP-8453 紫外 可见分光光度

11、计( 美国 Pharmacia Biotech) 。 1 2 方法 1 2 1 细胞培养 人胃腺癌 SGC-7901 细胞用含 10% 胎牛血清的 PMI1640 培养基，在 5% CO2 、 37 饱和湿度的培养箱中，2 3 d 用 0 25% 胰蛋白酶消化传代一次，取对数生长期细胞用于实验。 1. 2 2 倒置显微镜下观察 取对数期生长的 SGC- 7901 细胞，制成浓度为1 105 个/ ml 的细胞悬液，接种于 3 块 96 孔培养板中( 外孔加蒸馏水，中间 60 孔加细胞用于实验) ，每孔细胞数约 5000 个，置入CO2 电热恒温培养箱中24 h。24 h 后将培养液吸出，将 6

12、0 孔分为 6 组，第 1 组为 对照组( 加入上述方法制备的细胞悬液 200 l) ，第 2 6 组为实 验组，用培养基使 LBP 终浓度分别为 0 625、1 25、 2. 5、5、10 g / ml。每个浓度设6 复孔，于37 、5% CO2 饱和湿度条件下分别培养 24、48 和 72 h。分别在镜下观察 LBP 对胃癌细胞生长的影响。 1 2 3 噻唑蓝比色法( MTT) 计算细胞抑制率 取对数生长期的 SGC-7901 细胞，每孔 5000 个分别接种于 3 个 96 孔板( 24 h 板、48 h 板、72 h 板) ，每孔总容积达 200 l，各设 6 复孔。分设 对照组、 L

13、BP 组( 设 6 个浓度: 0 3125、0 625、1 25、2 5、5、10 g / ml) 。细胞经含 10% 优级胎牛血清的 PMI1640 培养基培养 24 h，细胞贴壁生长良好时，吸取原液，按设置的分组条件加入 LBP 培养液继续培养，3 个 孔板分别在 24、48、72 h 后在各孔加入5 mg / ml MTT 20 l，继续孵育 4 h 后弃原液，各孔加入标准浓度的 二甲基亚砜( DMSO) 200 l 终止，震荡 15 min，酶标 仪 490 /630 nm 双波长检测光密度值。计算( 24、48、72 h) 各药物浓度下 SGC-7901 细胞抑制率。公式: 细胞抑制

14、率( % ) = ( 1 实验组吸光度/ 对照组吸光度) 100% 。 1 2 4 Western 印迹法检测 取对数生长期的胃癌 SGC-7901 细胞，制成浓度为 1 105 个/ ml 的细胞悬液，接种于 6 孔培养板中，实验共分为 6 组，第 1 组为 对照组，第 2 6 组为实验组，各加入 LBP 终浓度分别为 0 625、1 25、2 5、5、10 g / ml 的溶液 2 ml 于 37 、5% CO2 条件下培养 48 h，吸取原培养液，PBS 重复洗涤离心 2 次。吸尽上清后，每孔加 200 l 细胞裂解液( 含 PMSF) 在冰上裂解 30 min， 12 000 r /

15、min 离心 5 min，取上清至于离心管中。分 别加入等量 2 SDS-PAGE 上样缓冲液，沸水加热3 5 min。上样于 12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS- PAGE 电泳) 。电泳直至溴酚兰到达分离胶底部。电泳后的凝胶切除积层胶，放入转移缓冲液中平衡30 min 左右。取出后由下至上将 3 层滤纸、膜、凝胶及 3 层滤纸依次放好( 硝酸纤维素膜用前需在转移缓冲液中平衡 10 15 min，滤纸用前在转移缓冲液中浸 湿，避免产生气泡) 。将其置于转膜槽中，凝胶一侧置于阴极，打开电泳仪，调电流 160 mA，转膜3 h 后关闭电源。取出膜在蒸馏水中漂洗 3 次。将膜置于封闭液中 4 封

16、闭 12 h。封闭过夜的膜用蒸馏水漂洗后，用 TBST 洗 4 次( 10 min / 次) ，加入一抗( 1 500 稀释) ，放入膜，室温下于摇床孵育 2 h，弃去一抗，蒸馏水洗膜 1 次，在摇用 TBST 洗 4 次( 10 min / 次) ，加入二抗( 1 1000 稀释) ，室温下于摇床孵育 1 h，用 TBST 洗 4 次( 10 min / 次) ，蒸馏水洗净。加入底物显色液显色后，放入蒸馏水终止 显色，记录结果。 1. 2 5 统计学处理 MTT 法所测抑制率以 x珋 s 表示，采用 SPSS17 0 软件处理数据，两组均数比较采用 t 检验，不同浓度不同时间采用重复测量方差

17、分析。不同浓度抑制率给予广义线性趋势检验，以 P 0 05为具有统计学意义。 2 结果 2. 1 倒置显微镜下观察对SGC-7901 细胞形态的影响未经药物处理的 SGC-7901 细胞大小均一，细胞核均匀，呈多边形贴壁生长。倒置显微镜下低浓度LBP( 0 625 g / ml) 作用24 h 后可见极少量SGC- 7901 细胞变圆、体积增大，大部分细胞仍贴壁生长， 作用 48、72 h 后，细胞变化不大。中等浓度 LBP ( 5 g / ml) 作用 24 h 后可见变圆细胞逐渐增多，贴壁生长细胞数量减少，脱壁漂浮的小圆球细胞及细 胞碎片逐渐增多，48 h 可见变圆细胞较前增多，贴壁生长细

18、胞减少，漂浮的小圆球细胞和细胞碎片增多，72 h 后可见大部分细胞呈凋亡小体样改变。高浓度 LBP( 10 g / ml) 作用 24、48、72 h 均为凋亡细胞样改变( 图 1) 。 图 1 不同浓度洛铂作用于 SGC-7901 细胞 24、48、72 h 后倒置显微镜观察( 400) A 对照组; B、C、D 0 625 g / ml 洛铂 24、48、72 h; E、F、G 5 g / ml 洛铂 24、48、72h; H、I、J 10 g / ml 洛铂 24、48、72 h 2 2 LBP 对胃癌 SGC-7901 细胞增殖的影响 根据实验及相关统计结果，在 48、72 h 下，随

19、LBP 浓度的升高对 SGC-7901 抑制作用增强( P 0 05) ，但 3 个时间段经线性趋势检验，均呈上升趋势( P 0 01) ，相同浓度下，随 LBP 作用时间的延长而明显受到抑制( P 0 05) ( 表 1，图 2) 。 表 1 不同浓度洛铂作用不同时间对 SGC-7901 细胞抑制率( % ，x珋 s) 浓度 g / ml 时间( t / h) 24 4872 0 3125 7 022 0 783 6 781 1 017 5 111 0 907 0 625 6 496 1 763 7 237 2 167 9 121 1 798 1 25 7 021 1 000 10 011

20、0 985 18 615 0 376 2 5 7 022 0 183 29 973 0 776 53 651 0 781 5 14 617 2 918 61 609 1 002 92 343 0 754 10 67 035 0 793 94 051 2 808 95 637 2 001 图 2 不同浓度 LBP 作用胃癌细胞 SGC-7901 的抑制作用1 0 3125 g / ml; 2 0 625 g / ml; 3 1 25 g / ml; 4 2 5 g / ml; 5 5 g / ml; 6 10 g / ml 2 3 Western 印迹检测 Bcl-2 蛋白的表达 对结果进行灰度

21、值分析，6 组 SGC-7901 的 Bcl - 2 蛋白灰度值逐渐降低。可见随 LBP 浓度的增高， 凋亡率亦增高，Bcl-2 的表达逐渐降低。提示 LBP 诱导的细胞凋亡与 Bcl-2 蛋白的表达有一定关系 ( 图 3) 。 3 讨论 图 3 不同浓度 LBP 作用于 SGC-7901Bcl-2 蛋白的表达情况 1 对照组; 2 0 625 g / ml; 3 1 25 g / ml; 4 2 5 g / ml; 5 5 g / ml; 6 10 g / ml P-tAG 链内交叉连接，阻碍 DNA 的复制和转录过程，从而干扰肿瘤细胞周期4。2002 年海南长安国际制药有限公司从德国 AS

22、TA 公司购买洛铂在中国的专利权及生产销售权，2005 年 3 月经国家食品药品监督管理局( SFDA) 批准洛铂作为国家一类新药上市。 胃癌主要的治疗方法包括外科手术、放疗和化疗，但多数确诊的患者都属胃癌中晚期，单纯手术治疗的效果往往不太理想，化疗是胃癌治疗的常用方法。化疗方案中铂类药物为最有效的化疗药物之一，目前胃癌化疗常用铂类药物有顺铂、奥沙利铂、卡铂等。洛铂是第三代铂类抗癌药物，有研究证实对于晚期胃癌，洛铂联合替加氟有效率优于奥沙利铂联合替加氟5。但洛铂应用于胃癌细胞基础研究的相关文献较少。 Bcl-2 基因包括作用相反的 2 个亚类，促进细胞凋亡的 bax 等基因和抑制细胞凋亡的 B

23、cl-2 等基因6。Bcl-2 主要功能是发现、登记和评价细胞内的损伤，整合相互矛盾和竞争信号，发出细胞命运的指令，作为抗凋亡基因，它不是通过加速细胞的有丝分裂，而是延长其生存期7。研究表明 Bax 和 Bcl-2在异型性增生及癌组织中的表达远高于炎 变组织，证实癌变前及胃癌发生早期即可出现 Bax 和Bcl-2 表达异常。且 Bcl-2 在胃癌的发生、发展中起LBP ASTA 3着重要的作用8。 是由德国公司开发研制的第代铂类抗肿瘤药物，其作用机制是通过形成 P-tGG 和 ( 下转第 614 页) 头烫或者徒手拍打，使蚂蟥自然死亡或掉落，或者直接用衣服挤压蚂蟥致死。这些方法都能起到一定作用

24、，但不能彻底解决问题。例如巡逻返程后，大多数被蚂蟥叮咬者仍被继续叮咬。叮咬后的伤口 不止，常用药物通常是红花油、风油精、乙醇等刺激性药物，人员反映不佳。 蚂蟥的 主要为咬伤后失血7。本次调查结果显示，巡逻人员在调查区域内受蚂蟥叮咬较为严重，人诱法蚂蟥密度达到 7 1 条/ ( 15 min人) ;蚂蟥叮咬还可对人员心理产生不良影响，蚂蟥引起人员心理恐惧的占 70% ; 被叮咬率 61% ，其中野外巡逻时被咬率为 100% 。 对蚂蟥的药物驱避和现场防治初步结果显示， 吡啶生物碱、苦参碱和联苯菊酯 3 种药物均有效果， 使用药物对作训服进行喷雾处理后，与对照组相比， 吡啶生物碱、苦参碱、联苯菊酯

25、 3 组人员对蚂蟥的驱避率分别为 87 2% ，74 4% 和 66 7% ; 显示出药物具 有明显的驱避效果，30 min 后在吡啶生物碱组、苦 参碱组的衣物上附着的蚂蟥取下后观察，死亡率分别为100% 和 50% 。以吡啶生物碱防治蚂蟥效果最佳。 【参考文献】 1 谭恩光，梁传精 不同农药对海南山蛭的毒力测定及其应用研究J 应用生态学报，2001，12( 2) : 266 268 2 杨 潼 七种杀虫剂对两种常见水蛭急性毒性效应的研究 J 中国环境科学，1989，9( 1) : 51 55 3 杨 潼 中国动物志环节动物门蛭纲M 北京: 科学， 1996: 263 4 杨振洲，石 华，史惠

26、勤，等 FGT-A 型便携式野外媒介生物标本采集保存运输检测系统的研制与应用J 中国媒介生物学及控制杂志，2008，19( 6) : 584 586 5 石 华，杨振洲，史惠勤 手持全球定位仪系统在疾病媒介标本采集中的应用J 卫生杀虫药械，2009，15( 2) : 152 154 6 杨振洲，储宸一，黄清臻，等 林芝地区蚂磺的生态学调查J 军事医学，2012，36( 8) : 613 615 7 张志文 山蚂蟥叮咬伤的防治J 中国蛇志杂志，1996，8 ( 4) : 49 ( 杨兆弘 编辑2012 12 19 收稿) ( 上接第 611 页) 本研究以胃癌细胞株 SGC-7901 为模型，通

27、过倒置显微镜观察证实，洛铂处理的 SGC-7901 细胞有明显的凋亡特征。MTT 结果表明，洛铂对体外培养的人胃癌 SGC-7901 细胞有显著的生长抑制作用，抑制率呈现时间浓度依赖性，在 72 h、10 g / ml浓度作用下呈现最高抑制率( 95 637% ) 。应用 Western 印迹法检测胃癌 SGC-7901 细胞 Bcl-2 蛋白表达，说明洛铂可使 Bcl-2 蛋白表达下降。总体显示洛铂对胃癌细胞有很明显的抑制作用。 综上所述，LBP 作为新研制的一种铂类复合物，具有较强的抗肿瘤活性的作用，可显著抑制胃癌细胞 SGC-7901 的体外增殖，引起细胞增殖抑制， 诱导细胞凋亡。本实验仅探讨了 LBP 单药对胃癌细胞株 SGC-7901 的抑制作用，LBP 是否优于其他铂 类，是否可与其他药物联合治疗胃癌，是否有协同作用等都有待进一步研究。 【参考文献】 1 Crew KD，Neugu