生物化学----蛋白质.ppt

1、第三章 蛋白质（氨基酸）,第一节 蛋白质通论 第二节 蛋白质组成 第四章 蛋白质结构 第四节 几种重要的蛋白质类型 第五章 蛋白质的性质 第六节 蛋白质的结构和功能的关系,蛋白质化学,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,Protein,第一节 蛋白质通论 一、蛋白质化学研究史,1838年 Muller研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后, 发现它 们均可以用C40H62N10O12 来表示, 命名为Protein (意为to take the first place),并发展成 基团 学说 1

2、9世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了13种氨基酸, 基团学说消声匿迹 1902年 Fischer同Hofmeiste时提出肽键理论 1924年 Svedberg 发明超离心机 1930年代 Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽 1950年 Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：-螺旋和-折叠 1953年 Sanger确定了牛胰岛素的一级结构 1958年 Perutz 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。 蛋白质分子为右手-螺旋。,（1）、-螺旋,-螺旋,（2）、稳定-螺旋的力,氢键,第n个AA(

3、NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键，环内原子数13。,（3）-螺旋的类型,左手 -螺旋 右手-螺旋,Pauling预测的三种螺旋结构,3.010 helix,16 helix, helix,-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。 -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,2、-折叠,（1）、反平行折叠,(2)、平行折叠,（3）、维持折叠的力,氢键： 折叠允许所有的氨基氢和羰基氧之间形成氢键。,3、-转角 -turn,在-转角

4、部分，由四个氨基酸残基组成; 弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。 这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,4、随机卷曲,随机卷曲也称无规卷曲，人们尚 未 未发现其规律，但随机卷曲往往和蛋白质的功能有关,四、超二级结构的类型,超二级结构 蛋白质多肽链一级结构中相邻的二级结构在形成空间结构时彼此靠近，形成二级结构的聚集体。 主要有以下几种类型 、： ,1、在蛋白质中(Rossmann折叠), - sheet 模式之一,折叠在蛋白质中的不同形式, - sheet模式之一, - sheet 模式之二, - sheet 模式之三,2、结构

5、域(domain)在空间上相对独立,免疫球蛋白,蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域,二蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。 维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。,血红蛋白的三级结构,血红蛋白由一条153个氨基酸组成的肽链和一个血红素辅基组成。 分子量为17800。 二级结构形成八段螺旋，分别为A、B、C、D、E、F、G、H，每段螺旋包含7-8个氨基酸，最长的有2

6、3个氨基酸。E7（第64His）和F8（第93His）和血红素连接。形成一个致密的球状结构。疏水AA位于分子内部，亲水AA位于分子表面。,三、蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。 这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位（Subunit），它一般由一条肽链构成，无生理活性； 维持亚基之间的化学键主要是疏水力。 由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白；,1、四级结构的结构模型,2、四级缔合在结构和功能上的优越性

7、,增强结构的稳定性 提高遗传经济性和效率 使催化基团汇集在一起 具有协同性和别构效应,两个亚基的结构,返回,作用力 破坏因子 氢键： -螺旋，-折叠 尿素，盐酸胍 疏水作用： 形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂 Van der Waals力：稳定紧密堆积的集团和原子 离子键：稳定-螺旋， 三、四级结构 酸、碱 二硫键：稳定三、四级结构 还原剂 配位键：与金属离子的结合 螯合剂 EDTA,四、维持蛋白质空间构象的作用力,H2NC(:NH)NH2 HCl,稳定蛋白质的作用力,1、共价键,蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（

8、受体蛋白或核酸）构成共价键，共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑制作用。,2、非共价键,生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成，而且具有选择性的识别。共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间，决定分子的基本结构，是分子识别的一种方式。 而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。,1)、静电作用,静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的各种静电吸引力。 酶、核酸、生物膜、蛋白质等生物大分子的表面都具有可电离的基团和偶极基团存在，很容易与含有极性基团的底物或抑制剂等生成离子键

9、和其它静电作用,（1)离子键,生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。,(2)离子偶极作用,药物分子和受体分子中O、S、N和C原子的电负性均不相等，这些原子形成的键由于电负性差值可以产生偶极现象。这种偶极部分与永久电荷可以形成静电作用. 离子-偶极相互作用一般比离子键小得多，键能与距离的平方差成反比，由于偶极矩是个向量，电荷与偶极的取向会影响药物-受体的作用强度。如普鲁卡因及其衍生物的局部麻醉作用与酯羰基的偶极性质有关。,(3)偶极-偶极相互作用,两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极两个偶极间的作用。 偶极偶极相互作用的大小，取

10、决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置。这种相互作用在水溶液中普遍存在。 它的作用强度比离子偶极作用小，但比偶极诱导偶极作用大。这种作用对药物受体相互作用的特异性和立体选择性非常重要,2)、氢键,氢键的形成 氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊形式的偶极偶极键。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。 氢键的大小和方向 氢键的键能比共价键弱，比范德华力强，在生物体系中为8.433.4kj/mol(2-8kcal/mol)。键长为0.250.31nm，比共价键短。氢键的方向用键角表示，是指XH与HY之间的夹角，一般为180250。,3). 范德华力

11、,这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。 这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.40.6nm(46A)时，这种力就表现出较大的集合性质。 范德华力包括引力和排斥力，其中作用势能与1/R6成正比的三种作用力（静电力、诱导力和色散力）通称为范德华引力。,4)、疏水作用,疏水作用是指极性基团间的静电力和氢键使极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团相互聚集所产生的能量效应和熵效应。 蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域，这是由构成它们的氨基酸侧链上的烷基链或苯环在空间上相互接近时形成的。 高分

12、子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构。,返回,第六章、几种重要的蛋白质类型,一纤维状蛋白 纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外保护成分， 占脊推动物体内蛋白质总量的一半成一半以上。 这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴短轴)大于1()(小于：10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肤链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。,二、纤维状蛋白质的类型,纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白)和可溶性二类，前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白

13、等； 后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不包括微管(microtubule)、肌动蛋白细丝(actin filament)或鞭毛( flagella)，它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)。,1、角蛋白 Keratin,角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是-角蛋白。 -角蛋白主要由-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手-螺旋肽链形成一个原纤维，原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性 例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。 -角蛋白的伸缩性能很好，当-角蛋白被过度-

14、拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时-角蛋白转变成-折叠结构，称为-角蛋白。,毛发的结构,一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIe cell)，中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20m。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。 毛发性能就决定于螺旋结构以及这样的组织方式。,角蛋白分子中的二硫键,卷发(烫发)的生物化学基础,永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。 这是因为角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在构象状态，

15、此外角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。,2、-角蛋白,丝心蛋白(fibroin)这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。它具有0.7nm周期，这与角蛋白在湿热中伸展后形成的角蛋白很相似(0.65nm周期)。丝心蛋白是典型的反平行式公折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象，酰胺基的取向使相邻的C为侧链腾出空间，从而避免了任何空间位阻。在这种结构中，侧链交替地分布在折叠片的两侧。,丝蛋白的结构,丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。

16、丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为： -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-,3、肌球蛋白和肌动蛋白,肌肉的构成,骨骼肌以及很多非肌肉细胞含有两种形成特有的纤维状或丝状结构的蛋白质：肌球蛋白和肌动蛋白。按生物功能来说它们不是基本的结构蛋白质，它们参与需能的收缩活动。 肌球蛋白是一种很长的捧状分子，有两条彼此缠绕的“螺旋肽链的尾巴和一个复杂的“头”。它的总分子量为450000，约160nm长，实际上含有六条肽链。 长尾巴是由二条分子量各为200000的肽链组成，这两条肽链称为重链(heavy chain H链)。重链具有柔软的可转动铰链。 头是球形的

17、，含有重链的末端和四条轻链(light chain，L链)，其中两条称作L2，分子量为18000，另外两条称为Ll和L3,分子量分别为16000和25000。肌球蛋白分子的头部具有酶活性，催化ATP水解成ADP和磷酸，并释放能量。许多肌球蛋白分子装配在一起形成骨骼肌的粗丝(thick filament)。肌球蛋白也存在于非肌肉细胞内。,在骨骼肌中与粗丝紧密缔合在一起的是细丝(thin filament)，它由肌动蛋白组成。肌动蛋白以两种形式存在，球状肌动蛋白(G肌动蛋白)和纤维状肌动蛋白(F肌动蛋白)。纤维状肌动蛋白实际上是一根由G肌动蛋白分子(分子量为46000)缔合而成的细丝。两根F肌动蛋

18、白细丝彼此卷曲形成双股绳索结构。,肌肉收缩过程,4、胶原蛋白,胶原蛋白或称胶原(collagen)是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，它也属于结构蛋白质，使骨、腱、软骨和皮肤具有机械强度。胶原蛋白至少包括四种类型，称胶原蛋白I、H、HI和IV。下面主要讨论胶原蛋白I。 腱的胶原纤维具有很高的抗张强度(tensile strength)，约为20-30kgmm2， 相当于12号冷拉钢丝的拉力。 骨铬中的胶原纤维为骨骼提供基质，在它的周围排列着经磷灰石(hydroxyapatite)磷酸钙聚合物Ca10(PO4)6(OH)2结晶。脊椎动物的皮肤含有编织比较疏松，向各个方向伸展的胶原纤

19、维。血管亦含有胶原纤维。,胶原蛋白的结构,胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。其基本组成单位是原胶原蛋白分子(tropocollagen)，长度为280nm，直径为1.5nm，分子量为300000。 原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。在电子显微镜下，胶原纤维呈现特有的横纹区带，区带间距为60-70nm，其大小取决于胶原的类型和生物来源； 原胶原蛋白分子在胶原纤维中都是有规则地按四分之一错位，首尾相接，并行排列组成纤维束。 由于原胶原肽链上残基所带电荷不同，因而电子密度不同，这样通过14错位排列便形成间隔一定的（大约70nm)电子密度区域，而呈现模纹区带。,胶原蛋白的二级结构是由三条肽链组成

20、的三股螺旋，这是种右手超螺旋结构。螺距为8.6nm，每圈每股包含30个残基。其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm，每一螺圈含3.3个残基,每一残基沿轴向的距离为0.29nm。 胶原三螺旋只存在于胶原纤维中。至今没有在球状蛋白质中发现。 组成原胶原蛋白分子的肽至少有五种，l(I)，l(II)，l(III)，1(IV)和2。胶原蛋白I是由两条1(I)和一条2组合而成的三螺旋，1(I)22。这五种肽链氮基酸顺序不同，它们的分子量介于95000到100000之间，含1000个残基左右. 一级结构分析表明，肽链的96%都是按三联体的重复顺序：(g1yxy)n排列而成。Gly数目占残基

21、总数的三分之一x常为Pro，y常为Hpro(羟脯氨酸)和Hlys（羟赖氨酸）。,胶原纤维中的交联结构,胶原蛋白,生物体内胶原蛋白网,二球状蛋白,球状蛋白是结构最复杂，功能最多的一类蛋白质。这类蛋白结构紧密，分子的外层多为亲水性残基，能够发生水化；内部主要为疏水性氨基酸残基。因此，许多球蛋白分子的表面是亲水性的，而内部则是疏水性的。典型的球蛋白是血红蛋白。 血红蛋白是一种结合蛋白。血红蛋白含有四条肽链，每一条肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。,1、血红蛋白,血红蛋白是脊椎动物红细胞主要组成部分，它的主要功能是运输氧和二氧

22、化碳。 血红蛋白中，血红素Fe原子的第六配价键可以与不同的分子结合：无氧存在时，与水结合，生成去氧血红蛋白(Hb)；有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白(HbO2)。 血红蛋白与氧的结合不牢固，容易离解。HbO2 的形成和离解受氧的分压和pH等因素的影响，氧的分压和pH较高时，有利于血红蛋白与氧的结合，反之，则有利于离解。,（1）血红素,血红素在蛋白中的位置,血红蛋白的功能,血红蛋白除了运输氧和CO2外，还能够对血液的pH起缓冲作用。因为HbO2在释放出一分子氧的同时，结合一个氢质子。这样就可以消除由于呼吸作用产生的CO2引起pH的降低。,煤气中毒的机制,一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原

23、子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。,2、免疫球蛋白,免疫球蛋白是一类血浆糖蛋白(serum glycoprotein)。糖蛋白中的蛋白质与糖是共价联接的。 免疫球蛋白是被脊椎动物作为抗体合成的。它的合成场所是网状内皮系统的细胞。这些细胞分布在脾、肝和淋巴节等组织中。 当一类外来的被称为抗原的物质，如多糖、核酸和蛋白质等侵入机体时即引起抗体的产生，这就是所谓免疫反应。抗体就是免疫球蛋白。,（

24、1）、免疫球蛋白的结构,（2）、免疫球蛋白G,人的免疫球蛋白可分为五大类，其分子量范围从150000到950000道尔顿。免疫球蛋白M(IgM)是对一个抗原作出反应时产生的第一个抗体。 免疫球蛋白G(IgG)是一类最简单的免疫球蛋白。IgG含有两条相同的高分子量的重链(heavy chain)和两条相同的低分子量的轻链(light chain)。 四条链通过二硫键共价联接成Y字形结构。每一免疫球蛋白分子含有二个抗原结合部位，它们位于Y形结构的二个顶点。,立体结构模型,抗体的特点,抗体具有两个最显著的特点，一是高度特异性，二是多样性。 高度特异性就是一种抗体一般只能与引起它产生的相应抗原发生反应

25、。抗原抗体复合物往往是不溶的，因此常从溶液中沉淀出来，此即“沉淀反应”。在体外，沉淀反应已被广泛用于研究抗原抗体反应，并成为免疫学的基础。多样性就是它们可以和成千上万的各种抗原(天然的和人工的)起反应。 般说来，一个抗原与接受该抗原的动物关系愈远，则产生抗体所需的时间愈短，抗体反应也愈强。,抗原抗体的作用,抗原,某些低分子量的物质可以与抗体结合，但它们本身不能刺激抗体的产生。如果它们与大分子紧密结合，则能刺激抗体的产生。这些小分子物质称为半抗原(hapten)。 几乎所有外来的蛋白质都是抗原，并且每种蛋白质都能诱导特异抗体的产生。一个人得体内在任一个给定时刻大约有10000种抗体存在。,抗体的

26、产生,第七章、蛋白质的性质,蛋白质、多肽与AA一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳。(Electrophoresis)。,一、蛋白质的两性解离和电泳现象,1、蛋白质在等电点的溶解度最小,2、电泳,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,几种常用的电泳,等电聚焦 纸电

27、泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 OFarrell的双向电泳,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,二、蛋白质的胶体性质,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,三、蛋白质的沉淀作用,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条

28、件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,三、蛋白质的沉淀作用,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,三、蛋白质的沉淀作用,不可逆沉淀,在外界变性因素的作用下，蛋白质的二、三级或二、三、四级结构发生异常变化，使蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质

29、的变性(denaturation)。蛋白质的变性涉及空间结构的改变，一级结构不变。,四、蛋白质的变性,蛋白质的变性,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,五、蛋白质的紫外吸收,蛋白质紫外吸收定量计算 光吸收值 A 的Beer-Lambert公式: A = kcl = log (Io/I) = -log T, T (透过率,%) = I / Io ; k, 消光系数; c, 摩尔浓度; l, 样品池长度; I, 光强度 对混合蛋白质样品, 1 OD280nm 1 mg/ml 对特定蛋白质的光吸收值的理论值: A=(5690Nw