神经毒剂的作用机理-2.ppt

1、（三）乙酰胆碱酯酶抑制剂,1、乙酰胆碱酯酶的结构与功能,1、乙酰胆碱酯酶的结构与功能,（1） AChE的基因结构及分子多态性,AChE均由单个Ace编码。在不同生物间Ace结构存在差异。人、鼠等，6个外显子（基因上含有蛋白质编码信息的部分，每个外显子均编码一个完整蛋白质的特定部分）、5个内含子（基因中除了外显子，剩余的DNA序列就构成了内含子，内含子被转录成RNA，但是接着就被剪切掉，因此内含子不编码蛋白质。 ）分布在4.5-4.7kb的碱基序列内；按蚊和黑尾果蝇 ，9个内含子和l0个外显子，其总长度分别为23kb和34kb。,（三）乙酰胆碱酯酶抑制剂,AChE是一大分子糖蛋白，糖基约占15。

2、AChE按其分子特征可分为球型（对称型）及尾型（不对称型）。球型单体(G1)分子量约70-80kD，单体通过单一的链间二硫键装配成二聚体(G2)，两个二聚体通过范得华氏力结合为四聚体(G4)。球型四聚体通过加入三股胶原样尾而成为尾(collagen-like tail)型四聚体（A4）。胶原性尾可通过二硫键直接与四聚体中的二聚体相连。每一个尾有三个联接点，可分别形成尾型八聚体(A8)及十二聚体(A12)。,（1） AChE的基因结构及分子多态性,球形分子依据其溶解性又可分为两亲分子(G-amphiphilic)和非两亲分子(G-nonamphiphilic)。AChE羟基末端3种不同类型的疏水

3、结构域对应于3种不同的酶分子：I型；型；尾部疏水性AChE。 昆虫，AChE简单，缺少胶质样尾的不对称分子和球形的四聚体分子，主要以GPL（乙醇胺-多聚糖-磷脂酰肌醇 ）锚着于膜上的二聚体形式存在，其次是GPL单体，另有极少量非两亲的二聚体和单体分子。,（1） AChE的基因结构及分子多态性,同一生物的不同AChE分子，其分子大小、形状、溶解性等理化性质存在差异，但这些不同的酶分子却具有相同的底物催化特性，其原因在于AChE氨基端的氨基酸序列在不同酶分子之间完全相同。该相同的氨基酸序列包含了AChE完成其催化功能所必须的所有氨基酸残基。因此，该段相同的氨基酸序列也叫做AChE的催化亚基。与催化

4、亚基羧基端连接的不同结构域决定着酶分子的类型和酶分子的理化特性。,（1） AChE的基因结构及分子多态性,（2） AChE的分布,主要分布在神经肌肉组织。 昆虫：中枢神经 ；肌肉、血淋巴 脊椎动物：中枢、周围 神经组织中的AChE主要是球型。 电鳐肌肉中的AChE几乎全部为A12型。哺乳动物肌肉AChE呈多型性，主要为A12AChE，也含有其他分子型AchE。,催化亚基是由15个螺旋、11个中央混合折叠和一个N端的短的3束折叠组成的大小为456065的椭球形分子；螺旋、折叠片在晶体中的含量分别为15、30，折叠片位于椭球形分子的中央而被螺旋所包围。 该分子结构最明显的特点是在球形分子的表面有一

5、向内凹陷的又深又窄的“峡谷”(gorge)，峡谷的深度达到20 ，相对于入口处其底部更加扩展。,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,AChE是一个异构化酶，它有三类作用部位：催化部位、结合部位及异构化部位。 催化部位和结合部位构成该酶的活性中心。 催化部位：又叫酯动部位，对乙酰胆碱、有机磷和氨基甲酸酯发生酰化都在这个部位，丝氨酸的OH基； 结合部位：催化部位周围的许多氨基酸残基都有可能成为结合部位，主要有阴离子部位、疏水部位、电荷转移复合体部位、靛酚结合部位、巯基结合部位等； 异构化部位：又叫外周离子部位。,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,7个功能

6、位点： 催化三联体。AChE的催化中心的3个氨基酸残基：第200位的丝氨酸(S200)、第327位的谷氨酸(G327)、 第440位的组氨酸(H440)均位于峡谷内，活性中心峡谷。这3个氨基酸组成称为催化三联体，即Ser200-Glu327-His440。在水解Ach时，位于谷底向上0.4nm处的活性位点Ser200的羟基靠近Ach羰基的碳原子，羰基上的氧通过氢原子结合到Glu119、Tyr121或Ala201位的两个酰胺骨架上而得到稳定。底物Ach的季铵离子通过静电作用和AChE的阴离子亚位点结合。而Ach的亲电子羰基碳原子分两步与AChE中酯动部位的Ser的羟基发生作用。首先是酶与底物结合

7、形成可逆的复合体，Ser的羟基攻击Ach的亲电子羰基上的碳原子，导致酶被乙酰化和释放胆碱；第二步是水分子中电负性的氧原子进攻乙酰化基团中的亲电子的碳原子，形成正常的酶和乙酸。,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,7个功能位点： 胆碱结合部位。峡谷内壁四周的芳基氨基酸残基在AChE与底物的结合过程中起重要作用。第84位的色氨酸(W84)、330位的酪氨酸(Y330)或苯丙氨酸(F330)、442位的酪氨酸(Y442)，其中的任何1个定向致突变，都显著的降低AChE与底物或配体的亲和力和酶的活性，上述3个芳基氨基酸残基与G199一起构成了AChE活性中心底物与酶的结合部位。,（3） AChE酶蛋

8、白结构及功能位点,7个功能位点： 酰基口袋。峡谷内壁一侧，分布着两个苯丙氨酸(F288、F290)，两者构成了AChE的“酰基口袋”(acyl pocket)，F288、F290通过其芳环侧链向“峡谷”内伸展，限制活性中心空间范围，从而限制结构较大的底物或配体分子进入活性中心。,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,7个功能位点： 氧阴离子洞。氧阴离子洞（oxyanion hole）可能是由Gly118、Gly119和Ala201的主链氮原子与羰基氧相互作用，以及酯键的氧与His440的咪唑基相互作用共同构成。Gly119作为底物结合位点的阴离子成分，与底物中4甲基的碳或胆碱的碳原子紧密接触。

9、,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,7个功能位点： 外周阴离子部位。在峡谷入口处，椭球形分子的外表面主要是由一些带负电的氨基酸Tyr70、Tyr121、Trp290和Asp72，组成了AChE的外周阴离子部位(PAS)。配体结合于PAS后，可以改变酶活性中心的立体构型，影响酶与底物或与其它配体的亲和力。不同的配体结合于PAS的不同位点，但所有配体的结合位点中均包含第72位的精氨酸和第279位的色氨酸。PAS的存在有助于提高AChE催化效率：乙酰胆碱进入活性中心之前，先通过静电吸引结合于PAS，然后顺势滑入到峡谷内并进一步扩散到活性中心，从而加快底物与活性中心的结合进程；另外，PAS可能还与

10、高浓度底物对酶活性的抑制作用有关。,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,7个功能位点： 芳香族基氨基酸形成谷内表面及芳香引导（aromatic guidance）机制。峡谷内壁四周主要是由14个疏水的芳香族基氨基酸(Tyr70、Trp80、Trp114、Tyr121、Tyr130、Trp233、Trp279、Phe288、Phe290、Phe330、Phe331、Tyr334、Trp432和Tyr442)组成。高度保守。峡谷中上部芳香补丁（aromatic patch），它们在AChE与底物的结合过程中起重要作用。谷壁表面疏水，可将Ach吸收到低亲和性部位，这就是芳香族氨基酸残疾所形成的芳香

11、引导机制。反应产物胆碱从谷中有效地、快速地清除也可能采取同样的机制。谷内芳香族氨基酸残疾的作用有可能加速底物向活性中心的扩散。,（3） AChE酶蛋白结构及功能位点,7个功能位点： “后门”及其开放机制。由Cys（半胱氨酸）67Cys95之间的“”噜噗（环）组成的活瓣样过渡构象。后门开放在酶的催化功能上具有重要的意义。,将乙酰胆碱水解为乙酸及胆碱。 乙酰胆碱具体被水解的过程，可以分为五步： （1）乙酰胆碱结合到阴离子部位上，它的铵氮的阳电荷与阴离子部位的阴电荷结合；,（4）AChE的功能,（2）形成了酶与乙酰胆碱的复合体 (EAX)； Kd = K+1 /K-1解离常数、亲和力常数； K+1结

12、合速率常数；K-1解离速率常数；Kd愈小， EAX 愈大（亲合力愈大）,（4）AChE的功能,EAX,EAX,AE,AE,（3）酶乙酰化反应，放出X（胆碱）取决于K2， K2速率常数（ K2 大，易放出X） （4）（5）水解反应，脱乙酰化反应，放出乙酸，酶恢复， 水解速率常数K3，快，（1/几 1/100msec）。,反应式：EAX EAX AE AE,（4）AChE的功能,因此，整个催化过程可以表示为： CH3COOC2H4N+(CH3)3,kd(k-l/k+l)，k2及k3在乙酰胆碱的情况下都发生得极快，特别是k3(去乙酰化作用)，只需百分之一毫秒。分解后产生的胆碱重新被突触前膜所吸收，乙

13、酸被一般细胞均能吸收。它们与辅酶A结合，形成乙酰辅酶A，然后，运送到前突触中，在胆碱乙酰转移酶的作用下重新合成乙酰胆碱。,（4）AChE的功能,CH3COOHHOC2H4N(CH3)3,EAX,EAX,AE,AE,结合部位 阴离子部位 疏水基部位 电荷转移复合体 吲哚苯基结合部位 催化部位 （酯动部位）丝氨酸羟基 相邻组氨酸的咪唑基活化丝氨酸OH 诱导反应，整个反应很快，仅23msec,AChE,酶与乙酰胆碱的季铵基团N+(CH3)3结合,图5 久效磷对家蝇和粘虫的致毒症状 A 痉挛，示足、翅异常；B 死亡，示足异常、口器伸出；C 兴奋；D 痉挛，示呕吐；E 昏迷；F 对照；G 死亡,A,B,

14、C,D,E,F,G,2、OP杀虫剂对AChE抑制作用,图6 辛硫磷对家蝇和粘虫的致毒症状 A 昏迷，示足、翅异常，且口器伸出；B 兴奋；C痉挛；D 昏迷，示体皱缩，且拉出部分直肠；E 对照；F 死亡；G 呕吐致滤纸变色,A,B,C,D,E,F,G,图7 马拉松对家蝇和粘虫的致毒症状 A 昏迷，示口器、足异常；B 昏迷，示足、翅异常；C死亡，示产卵部分伸出，足、翅异常；D 兴奋；E 痉挛；F 对照；G 死亡,A,B,C,D,E,F,G,分为兴奋、痉挛、昏迷和死亡四个阶段。兴奋期的主要症状为：试虫的运动速度、强度明显增强，不停地爬动或起飞；痉挛期的主要特点是试虫的触角、口器、足、翅等器官颤抖、抽搐

15、，反吐胃液，排泄异常，甚至会拉出直肠，或生殖器外伸，难以缩回；昏迷期的特点为试虫静卧不动，但对机械刺激有反应；死亡期的特点为试虫体壁干燥，体躯皱缩，体长仅为对照的一半。另外，在兴奋前，试虫有一定的安静期。,有机磷类杀虫药剂的致毒症状,2、OP杀虫剂对AChE抑制作用 （1） 酶活性的抑制： EPX PXE PEPE 第一步 形成可逆性复合体（ PXE 存地时间短） 第二步 酶磷酰化反应，P原子（亲电性）与酶丝氨酸OH反应，亲电性愈强，对酶抑制能力愈强，X基团分离能力愈大。 K2磷酰化反应速率常数很快 第三步酶去磷酰化，K3速率常数，几乎不发生,K+1,K-1,K2,X,K3,（2） 酶活性的恢

16、复 酶经磷酰化后，虽然水解作用极为缓慢，但仍然能自发地放出磷酸并使酶复活，这一反应称为自发复活作用或脱磷酰化作用。 EP+H2O EH+P一OH 自发复活速度与抑制剂的离去基团无关，而取决于磷原子上残留的取代基以及酶的来源。亲核试剂攻击磷酰化酶中的P原子而取代它们。AChE复活剂：羟胺(NH2OH)（弱）、肟、羟肟酸（强）引入阳离子活性更强。,（解磷定）,（3） 磷酰化酶的老化 老化：指磷酰化酶在恢复过程中转变为另一种结构，以至于羟胺类的药物不能使酶恢复活性。老化现象是由于二烷基磷酰酶的脱烷基反应造成的。 磷酰化酶的老化速率与磷酰基上的烷基有关。二乙基磷酰化酶老化缓慢，但甲基、仲烷基及苄基（苯

17、甲基）酯的老化速度要快得多。 老化反应速度取决于非酶的化学力，发生烷基磷酸酯基C一O键的断裂。因此，酶如果受烷基化能力高的磷酸酯的抑制，老化现象易于发生。,有机磷化合物的结构与其对AChE的抑制作用有关。 含P=S键。在离体情况下不能抑制AChE或抑制作用很低，但在活体情况下，P=S转化为P=O后，则对AChE抑制可增强几百倍，甚至几千倍。例如，对硫磷转化为对氧磷后对AChE的抑制作用增强10000倍以上。,2、OP杀虫剂对AChE抑制作用,苯基磷酸酯的间位引入取代基，如甲基对硫磷苯环的间位引入甲基称为杀螟硫磷，毒性1/180，杀虫活性相当。原因：大大地增强了对家蝇AChE的抑制作用，而降低了

18、对哺乳动物AChE活性。原因：昆虫，AChE的阴离子部位与酯动部位之间的距离位0.50.55nm，而在哺乳动物0.430.47nm，苯环间位烷基与磷原子的距离为0.520.62nm，因而间位烷基能很好地附着于昆虫的阴离子部位，使酯与其的亲和力增强，促进酶抑制剂复合物的形成；而哺乳动物AChE却因为距离匹配性差而不利于酶抑制剂复合物的形成，亲和力就不强。这就是这类化合物具有选择毒性的原因所在。 另外，有机磷的手性对AChE的抑制作用也有影响。,2、OP杀虫剂对AChE抑制作用,1. 抑制神经细胞的生长发育： AChE的催化作用能增强神经轴突的生长，因而，在AChE活性被有机磷杀虫剂抑制后，即使未

19、致死亡，机体神经细胞的生长发育也受到阻碍。毒死蜱可以抑制PC12细胞的有丝分裂和轴突的长出，抑制神经细胞DNA的合成，在远低于使AChE活性抑制所需要的浓度时即可引起与脑发育有关的分子-磷酸化的Ca2+ cAMP介导的反应元件结合蛋白(CREB)的活性增加。可见，有机磷杀虫剂不仅具有胆碱能毒性，还具有非胆碱能毒性作用。,有机磷杀虫剂的其他作用机理：,有机磷杀虫剂的其他作用机理：,2. 抑制乙酰胆碱受体：乐果可以增强肌细胞膜上的nAChR的表达。它可通过结合到非竞争性位点改变该受体的构型或是直接阻断nAChR通道而抑制其功能。 3. 影响神经突触的ACh的释放：毒死蜱可以作用于突触膜上的自主型n

20、AChR，抑制这些自主受体的功能，从而影响ACh的释放。 此外，有机磷杀虫剂还对大脑突触体的钙离子通道功能有抑制作用，例如：甲胺磷(methamidophos)可以使脑突触体钙摄取减少，说明甲胺磷影响了膜上的电压敏感型钙离子通道。,图8 灭多威对家蝇和粘虫的致毒症状 A 昏迷，示翅、足异常；B 兴奋；C 痉挛；D 、E 昏迷；F 死亡；G 对照,A,B,C,D,E,F,G,3、氨基甲酸酯类对乙酰胆碱酯酶的抑制作用,图9 呋喃丹对粘虫的致毒症状 A 痉挛；B 昏迷；C 死亡；D 对照,图10 丁硫克百威对家蝇的致毒症状 A 痉挛；B 昏迷；,A,B,C,D,A,B,致毒症状主要分为兴奋、痉挛、昏迷和死亡四个阶段。各阶段的症状特点和有机磷杀虫药剂的几乎相同，即：在兴奋期，主要症状为试虫的运动速度加快、运动强度明显增强；痉挛期的主要特点是试虫的触角、口器、足、翅等器官颤抖、抽搐，反吐胃液，排泄异常，甚至会拉出直肠，或生殖器外伸，难以缩回；昏迷期的特点为试虫静卧不动，但对机械刺激有反应；死亡试虫的体壁干燥，体躯皱缩，体长仅为对照的一半。 和有机