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1、第五章 发酵过程控制,a适应期(迟滞期) b对数生长期期 c稳定期(平稳期) d死亡期(衰老期),ab菌体生长阶段c产物合成阶段d菌体自溶阶段,第一节、发酵过程的主要控制参数,(一)物理参数 1温度() 发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。 影响酶反应速率、氧在培养液中的溶解度与传递速率、菌体生长速率和产物合成速率 2压力(Pa) 发酵过程中发酵罐维持的压力, 罐内维持正压可以防止外界空气中的杂菌侵入,保证纯种的培养,间接影响菌体代谢。一般维持在0.21050.5105Pa。,3搅拌转速(rmin) 搅拌转速是指搅拌器在发酵过程中的转动速度,通常以每1min的转数来表示。 它的大小与氧在发酵
2、液中的传递速率与发酵液的均匀性有关。 4搅拌功率(kw) 指搅拌器搅拌时所消耗的功率,常指每1m3发酵液所消耗的功率(kwm3)。 它的大小与氧容量传递系数有关。,5空气流量V(Vmin),简称VVM 每1min内每单性体积发酵液通入空气的体积,也是需氧发酵的控制参数。 与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在0.51.0V(Vmin)范围内。 6粘度(Pas) 粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志,也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。 通常用表观粘度表示之:它的大小可改变氧传递的阻力。,7浊度() 浊度是能及时反映单细胞生长状况的参数,对某些产品的生产是极其重要的参数。一般采用分光光
3、度计的波长420660 nm测量。浊度对氨基酸、核苷酸等产品的生产是极其重要的。 8. 料液流量(Lmin) 这是控制流体进料的参数。,(二)化学参数,1 pH(酸碱度) 发酵液的pH是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。 它是发酵工艺控制的重要参数之一。它的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。,2基质浓度(g或mg) 是指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。 它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响,也是提高代谢产物产量的重要控制手段。 在发酵过程中,必须定时测定糖(还原糖和总糖)、氮(氨基氮或氨氮)等基质的浓度。,3溶解氧浓度10-6(ppm)或饱和度() 溶解
4、氧是需氧菌发酵的必备条件。 利用溶氧浓度的变化,可了解产生菌对氧利用的规律,反映发酵的异常情况,也可作为发醉中间控制的参数及设备供氧能力的指标。 溶氧浓度一般用绝对含量(10-6)来表示、有时也用在相同条件下,氧在培养液中饱和浓度表示。,4产物的浓度g(u)ml 这是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数,也是决定发酵周期长短的根据。 5废气中的氧含量() 废气中的氧含量与产生菌的摄氧率和供氧系数有关。 从废气中的O2的含量可以算出产生菌的摄氧率和发酵罐的供氧能力。,6废气中的CO2浓度() 废气中的CO2就是产生菌呼吸放出的CO2。测定它可以算出产生菌的呼吸熵,从而了解产生菌的呼吸代谢
5、规律。 .氧化还原电位(mV) 也是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。对微生物,培养基最适宜和所允许的最大电位值,应与微生物本身的种类和生理状态有关。 其他化学参数:DNA、RNA、生物合成的酶等。,(三)生物参数,1菌丝形态 丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。 一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。,2菌体浓度 菌体浓度简称菌浓,是控制微生物发酵的重要参数之一。 大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响 在生产上,常常根据菌体浓度来决定适合的补料量和供氧量,以保证生产达到顶期的水平。,(发酵液的菌体量和单位时间的菌
6、浓、溶氧浓度、糖浓度、氮浓度和产物浓度等的变化值) 计算 (菌体的比生长速率、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生产速率) (控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件) 研究 发酵动力学,(三)发酵参数在发酵过程控制中的作用,由此可见,取得发酵过程中正确可靠的各种数据是研究动力学的前提。遗憾的是现有的能直接从发酵罐中测量的参数不多,还难于做到把许多有用的参数就地通过传感方式变成各种输出信号。 目前较常测定的参数有温度、罐压、空气流量、搅拌转速、pH、溶氧、效价、糖含量、前体(如苯乙酸)浓度、菌体浓度(干重、离心压缩细胞体积%)等。不常测定的参数有氧化还原电位、粘度、排气中的O2和
7、CO2含量等。,发酵过程各参数概况,第二节、发酵过程控制,一、温度变化及控制 1.温度对发酵的影响 (1)影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质。 在一定范围内,随着温度的升高,酶反应速率也增加,但有一个最适温度,超过这个温度,酶的催化活力就下降。温度对菌体生长的酶反应和代谢产物合成的酶反应的影响不同。 如产黄青霉菌体的最适生长温度为30,黑曲酶的最适生长温度为37度,(2)温度还能改变菌种代谢产物的合成方向,细胞生长和代谢产物积累的最适温度也往往是不同的。 例如,青霉素产生菌的生长最适温度为30度,而产生青霉素的最适温度为25度;,(3)影响发酵液的物理性质。 发酵液的粘度、基质和氧在发酵液中的
8、溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等。,2.最适温度的选择,(1)根据菌种及生长阶段选择 前期菌量少,取稍高的温度,使菌生长迅速; 中期菌量已达到合成产物的最适量,发酵需要延长中期,从而提高产量,因此温度要稍低一些,可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。 后期产物合成能力降低,延长发酵周期没有必要,就又提高温度,刺激产物合成到放罐。,如: 四环素生长阶段280C,合成期260C后期再升温; 黑曲霉生长370C,产糖化酶32340C。 最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,(2)根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑,
9、灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度,使菌呼吸速率降低些,溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时,温度也该低些。因为温度高营养利用快,会使菌过早自溶。,(3)根据菌生长情况 生长快的菌种,维持在较高温度时间要短些;生长慢的菌种,维持较高温度时间可长些。培养条件适宜,如营养丰富,通气能满足,那么前期温度可髙些,以利于菌的生长。 总的来说,温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,3.发酵热的产生和控制 (1)生物热(Q生物): 产生菌在生长繁殖过程中产生的热能。 生物热与发酵类型有关 微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多 一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水
10、 好氧:产生287.2千焦耳热量, 183千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放 厌氧:产生22.6千焦耳热量, 9.6千焦耳转变为高能化合物 13千焦以热的形式释放 生物热的大小,还与菌种和培养基成分等不同而变化。,(2)搅拌热(Q搅拌):搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。 搅拌热与搅拌轴功率有关,可用下式计算: Q搅拌P8604186.8(焦耳/小时) (3)蒸发热(Q蒸发):空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后,引起水分蒸发所需的热能。 (4)辐射热(Q辐射):由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量。,Q发酵= Q生
11、物+ Q搅拌Q蒸发Q辐射,发酵过程中,发酵液温度变化取决于上面几个因素:,总的来说抗生素发酵是一个放热过程。对温度通过冷却进行控制。 夹套 冷却蛇管,二、 pH的影响与控制,1. pH对发酵的影响 (1)发酵过程中微生物的正常生长需要有一定的pH值,不同的微生物对PH值的要求也是不同的。,酵 母:pH 3.86.0,细 菌:pH 6.57.5,霉 菌:pH 4.05.8,放线菌:pH 6.58.0,(2)影响酶的活性,当pH值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢; (3)影响微生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄; (4)pH值不同
12、,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。,酿酒酵母,pH:4.5-5.03,乙醇 发酵,pH:8.0,甘油发酵,2.影响pH值变化的因素 菌体本身具有一定的调整周围环境pH值,构建最适pH值的能力。,(1)基质代谢 糖代谢:C源过多,糖分解成小分子酸、醇,使pH下降。糖缺乏,pH上升,是补料的标志之一 氮代谢:当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降;尿素被分解成NH3,pH上升,NH3利用后pH下降,当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,(2)产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性,使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降,红霉素、洁霉
13、素、螺旋霉素等抗生素呈碱性,使pH上升。,(3)菌体自溶,pH上升,发酵后期,pH上升。,3.发酵过程中pH值的调节及控制 (1) 发酵pH值的确定 一般是在58之间,上限8.5,下限2.5 随菌种和产品不同而不同。同一菌种,生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。 按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH,使产量最大。,例 pH对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始,葡萄糖转化为有机酸类中间产物,发酵液pH下降,待有机酸被生产菌利用,pH上升。若不及时补糖、酸,发酵液pH可迅速升到8.0以上,阻碍或抑制某些酶系,使林可霉素增长缓慢,甚至停止。,(2)发酵pH的控制: 调整基础培养基
14、:适当调整C/N比,或加入产酸或产碱物料作用有限 补料控制:可直接补加酸、碱性物质 一般加生理性酸碱 pH低:补尿素、氨水 pH高:硫酸氨 加生理性酸碱,即可调节pH,同时补充营养。,三、溶氧的影响和控制,1. 定义: 溶氧(DO)指溶解在发酵液中的氧。单位ppm (毫克分子/升) 2.DO对发酵的影响 DO不足:微生物代谢异常,产量下降,菌体过早衰老死亡; DO太多:发酵液泡沫过多,抑制产物生产,同时空气消耗增加。,3. 溶氧(DO)的判断 一般发酵液的DO范围在20-25ppm,在菌体生长阶段及产物合成阶段氧的需求最大,DO表现最低。而菌体进入衰老自溶阶段后,DO的浓度会逐步升高。 4.D
15、O的测定:溶氧电极传感器(氧化还原反应) 5.DO的控制:搅拌转速-搅拌器 通气速率,四、 泡沫的影响与控制,一、泡沫的性质及对发酵的影响 1.产生原因: 2.泡沫的性质: 发酵液液面上的泡沫,气相所占的比例特别大,与液体有较明显的界限,如发酵前期的泡沫; 发酵液中的泡沫,又称流态泡沫,分散在发酵液中,比较稳定,与液体之间无明显的界限。,使发酵罐的装填系数减少; 造成大量逃液,导致产物的损失,增加了染菌的机会; 氧传递减弱; 使微生物菌体提早自溶,降低发酵物产量。,3.对发酵的影响:,4.泡沫的控制 泡沫的控制,可以采用三种途径: (1) 调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变
16、某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度。,(2)机械消沫 靠机械引起的强烈振动或压力的变化促使气泡破裂。 罐内消沫法:在搅拌轴上方装消沫桨,通过消沫 桨转动打碎泡沫。 罐外消沫法:将泡沫引出罐外,通过喷嘴的加速 作用或利用离心力来消除泡沫。 优点:不需加入外界物料,可节省原料,减少污染 杂菌的机会。 缺点:消沫效果不理想,仅可作为辅助的消沫方 法。,(3)消沫剂消沫(化学消沫)-最常用,有效,化学消泡剂的要求(或化学消泡剂的特点),化学消泡剂必须是表面活性剂,具有较低的表面张力,消泡作用迅速有效
17、; 具有一定的亲水性,以使消泡剂对气液界面的分散系数足够大,从而迅速发挥消泡活性; 在水中的溶解度必须较大,以保持持久的消泡或抑泡性能; 对人、畜及微生物细胞无毒性; 应不影响氧在培养液的溶解和传递; 必须来源方便、广泛,价格便宜。,常用的消沫剂主要有天然油脂类,高碳醇、脂肪酸和酯类,聚醚类,硅酮类4大类。 (1)天然油脂类:玉米油、米糠油、豆油、松子油、菜子油、鱼油、猪油等。 优点:来源比较丰富,价格比较低廉,在发酵中不仅用于消沫,还可以作为供产生菌利用的碳源和中间控制的手段。 缺点:分子中无亲水基,在发泡介质中难铺展,消泡活性差。并且油的成本和折粮单耗都比较高且用量大,已逐渐被合成消沫剂取
18、代。,(2)高碳醇和酯类:十八醇、聚乙二醇、苯乙酸酯类(苯乙酸乙酯、苯乙酸丁酯、苯乙酸月桂醇酯)、苯乙醇、苯乙醇油酸酯等。 多适用于丝状真菌发酵。,(3)聚醚类。,聚氧丙烯甘油:亲水性差,在发沫介质中溶解度小。抑泡性能优于消泡性能。适用于稀薄发酵液。 聚氧乙烯氧丙烯甘油:亲水性好,在发沫介质中易铺展,消沫能力强。相应的溶解度大,消沫活性持续时间短。适用于粘稠发酵液的消沫。 聚醚类优点:性能稳定、使用简便、易控制、用量少、成本低。,(4)硅酮类:聚二甲基硅氧烷及其衍生物。 适用于微碱性细菌发酵。,消沫剂消沫优缺点: 优点:效果好,较机械消沫作用迅速,尤其是化学合成消沫剂用量少。 缺点:消沫剂使用
19、不当时对菌的生长代谢有干扰;发酵过程中经常添加消沫剂增加原材料单耗;设备不严密时增加染菌机会;残留的消沫剂可能造成提炼上的麻烦。,五、 罐压的影响与控制,1、罐压的影响和作用 罐压影响二氧化碳和氧气的溶解度; 影响微生物的生长; 防止发酵污染。 2、罐压的控制 控制罐压方法一般为调节空气进口阀门或排气出口阀门的开启度,改变进入或排出气体的流量、维持工艺所需的压力。,六、基质及菌体浓度的影响及其控制,(一) 碳源浓度(糖含量)变化及其控制 1.培养基中的碳源 快速利用碳源(如葡萄糖) 能较迅速地参与代谢,合成菌体和产生能量,并产生分解产物(如丙酮酸等),有利于菌体生长。 慢速利用碳源 为菌体缓慢
20、利用,有利于延长代谢产物的合成,特别有利于延长抗生索的分泌期。,For 青霉素: 现象:在迅速利用的葡萄糖培养基中,菌体生长良好,但青霉素合成量很少;相反,在缓慢利用的乳糖培养基中,青霉素的产量明显增加。但发酵周期很长。,工业中常以较低的浓度和慢速利用碳源一起组成基础培养基中的混合碳源,供菌体生长用。,2.糖含量的测定 总糖(单.双.多糖):取样水解(酸) 测定 还原糖:直接测定 3.糖的调控:定期测定糖含量,特别还原糖含量。 目的:可间接反映菌丝生长反之及产物合成等情况。做为补糖的依据。,(二)氨基氮(氮源)的调控 1.培养基中氮源的种类 迅速利用的氮源:氨基(或铵)态氮的氨基酸(或硫酸铵等
21、)和玉米浆等;容易被菌体所利用,促进菌体生长,但对某些代谢产物的合成,特别是某些抗生素的合成产生调节作用,影响产量。 缓慢利用的氮源:黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉等蛋白质。延长次级代谢产物的生产期、提高产物的产量。一次投入全量容易促进菌体生长和养分过早耗尽,以致菌体早衰自溶,缩短产物的生产期。,3.测氮目的: 氮源的含量及消耗可直接反映菌丝体的生长状况。 4.氮的测定: 取样加热或加碱除氨气测氮,2.生产上采用的方法: 设计发酵培养基:选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。,(三)菌丝浓度及浊度,1.菌丝浓度定义:即单位体积培养液中菌丝体的数量。 2.菌丝浓度变化的意义,发酵前期:从孢子到菌丝
22、浓度最大菌丝浓度。 发酵中期:稳定期,菌丝浓度变化不大 发酵后期:菌体衰老死亡菌丝浓度,意义:通过菌丝浓度的变化可以判断和了解发酵周期,3.菌丝浓度测定:,湿重法:发酵液过滤 吸水称重 干重法:发酵液过滤 吸水干燥恒重 体积法:发酵液离心 体积百分数(常用方法) 浊度法:与浓度成正比,测定比色或比浊计,干重的2-5倍,a适应期(迟滞期) b对数生长期期 c稳定期(平稳期) d死亡期(衰老期),ab菌体生长阶段c产物合成阶段d菌体自溶阶段,第三节 发酵过程的代谢变化,1菌体生长阶段 碳源、氮源进行分解代谢:碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗,浓度明显减少。 菌体进行合成代谢:菌浓明显增加、摄
23、氧率不断增大,溶氧浓度不断下降。至菌丝浓度最大,溶氧浓度最小。,2产物合成阶段 (产物分泌期或发酵中期) 这个阶段主要是合成抗生素。 以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主,菌体的生长达恒定(DNA含量恒定),进入合成阶段的稳定期。 该阶段是发酵调控的主要阶段,外界环境的变化很容易影响这个阶段的代谢,破源、氮源和磷酸盐等营养物质的浓度必须控制在一定的范围内,使该阶段的持续时间尽量延长。如该阶段营养过剩,则菌体进行生长繁殖,抑制产物的合成,如营养过少,菌体会过早衰老死亡。,3菌体自溶阶段(菌体自溶期或发酵后期) 菌体衰老,细胞开始自溶,氨氮含量增加,pH上升,产物合成能力衰退,生产速率下降。
24、 发酵到此期必须结束。,第四节 中间补料及控制,一、微生物发酵方式: 分批发酵(batch fermentation) 补料分批发酵(fed-batch fermentation) 连续发酵(continuous fermentation),(一)分批发酵 1、定义: 把培养液一次性装入发酵罐,灭菌后接入一定量的种子液,在最佳条件下进行发酵培养。 2、特点 发酵周期短,产品质量易控制,不易发生杂菌污染,对原料组成要求较粗放。 发酵体系中开始时基质浓度很高,到中后期营养物质浓度很低,这对发酵反应不利。,1、定义: 指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基,同时以相同的速度流出培养液,从而使培养
25、系统内培养液的液量维持恒定,使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物培养方式。 2、特点: 优点:在发酵过程中慢慢地加入培养基,使其在发酵液中保持适宜水平,同时又稀释了生成的产物浓度,避免了高浓度产物和底物的抑制作用,也防止了后期养分不足而限制菌体生长。 缺点:受发酵罐操作容积的限制;微生物菌种容易发生变异和退化;发酵过程易染菌;新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合,影响培养和营养物质的利用。,(二)连续发酵,(三)补料分批发酵(FBC): 又称半连续培养或半连续发酵,是指在分批发酵过程中,间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法,是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式,
26、是一种控制发酵的好方法,现已广泛用于发酵工业。,FBC的优点: 解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏; 避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响,改善发酵液流变学性质; 可提高发芽孢子的比例,控制细胞质量; 不需要严格的无菌条件,产生菌不易老化变异,比连续发酵适用广泛。,二、中间补料 1、定义:中间补料是指在发酵过程中补充某些营养物料。 2、补料的原则 根据菌体生长代谢规律、生产需要及环境条件补料,补料的量要求是充足而不过量。,、补料的目的 解除基质过浓的抑制 解除产物的反馈抑制 解除葡萄糖分解代谢阻遏效应,、补料内容 补糖; 氮源; 微量元素; 全料和水;,(1)补糖(碳源和
27、能量);,补糖时机 过早,刺激生长,加速糖利用; 过迟,所需能量跟不上。菌丝内在质量受损,产物产量降低 判断:发酵状况(残糖,pH,菌形态等),在需要时加入;,(2)补氮;,有调节pH作用的氮,无调节pH作用的氮:酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等。,氨水: (硫酸氨) 尿素:,20%氨水,为避免局部浓度过高。常由空气分布管通入,接搅拌器作用混合。,分解过程长,效力缓慢而持久。,(3)补加无机盐;,磷元素:微生物代谢对磷的要求很高,磷的代谢速度也很快,缺少时会影响发酵的进行。故多数抗生素发酵需补磷。 补加磷酸盐:如磷酸二氢钾 举例:在四环素发酵中,间歇、微量添加磷酸二氢钾,有利于提高四环素的产量。,(4)补全料和水;,补全料:菌体和培养液一起装入发酵罐,在菌体生长过程中,每隔一定时间取出部分发酵培养物,同时补充同等数量的新培养基,然后继续培养,直到发酵结束,取出全部发酵液。 适合于产物合成期长的抗生素,可提高产量。 补水:对某些发酵过程中菌丝浓度或黏度大的抗生素。菌浓或
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