基因表达沉默技术.ppt

1、1,药学系药物基因组学教研室 2010.06.18,基因表达沉默技术,2,教学内容及要求,1,2,3,4,反义核酸技术,核酶技术,基因敲除技术,RNA干扰 技术,重点,熟悉,3,参考资料,基因工程及其分子生物学基础-基因工程分册，北京大学出版社，静国忠编 自备材料（个人实践经验）,4,第一节 RNA干扰技术,5,掌握,RNA 干扰 (RNA interference, RNAi):由小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 小干扰RNA: 具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA)。,6,注射,sense,秀丽线虫,

2、antisense,1995年 ,7,反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱； 而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的表达。,an important finding！, 1998年,8,Craig C. Mello克雷格梅洛,Andrew Z. Fire 安德鲁菲尔,2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine,9,随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。,10,靶,siRNA在ATP参与下形成RISC复合体，被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中的反义链指导移至靶mRNA，靶mR

3、NA被切割后诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。,外源长dsRNA在ATP作用下被RNase Dicer切割成21nt左右、由正义和反义链组成的siRNA,重点,11,siRNA,21 nt,难点,12,1）靶序列的调出,,National Center forBiotechnology Information,13,14,15,2）利用免费设计软件进行siRNA设计,Invitrogen Takara Oligoegine,16,软件的选择原则,1、选择可读框内、翻译起始位点之后50100nt的序列作为靶序列； 2、选择的靶位5端之前的

4、两个碱基为AA； 3、GC含量控制在35%65%,最好50%左右； 4、碱基数目控制在1921nt； 5、避免连续3个或3个以上的相同碱基； 6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构； 7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。,17,我用的软件：siDirect,18,3）siRNA合成或表达,RNA聚合酶启动子（包括U6或H1）： 转录起始点明确； 转录生成小RNA； 转录产物无polyA尾； 转录终止为5个连续的U。,19,20,21,22,3 mg/ml 正向引物 1 l 3 mg/ml 反向引物 1 l,90C 4 min,70C 10 min,室温,订购合成的引物序列退火,2

5、3,4) siRNA working?,24,mRNA:Real-time PCR Protein: Western blot,17siRNA Mock,25,5)合成or构建载体？,化学合成siRNA： 瞬时转染 实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。 B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达siRNA。 C. 载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞用逆转录载体或慢病毒载体。,26,6）体外导入细胞,a.脂质体转染：,具体操作步骤： 按照脂质体说明书进行,27,b.电穿孔导入：,28,c.病毒感染

6、（以腺病毒为例）：,29,next,30,第二节 反义核酸技术,31,1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核酸技术”的概念。,Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.,32,反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义DNA和

7、反义RNA。,反义RNA技术,反义DNA技术,33,直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶H降解。,反义核酸,mRNA,RNase H,34,论著超过篇。 基因功能研究（ 1994年流行） 如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。,35,1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物“Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%

8、。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。,2个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 ,36,a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力,H,deoxyribose,提高有效性,技术难点,修饰,37,第一代硫代修饰（Phosphorothioate）,Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways,O,38,第二代修饰(2-O-methyl,2-O-methoxyethyl),Resisting

9、 To Nucleases；not activating RNase H pathways,39,2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症,Macugen 哌加他尼,40,2003 新一代抗HIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物,Fuzeon,20570$,41,Tysabri,2004 专治多发性硬化症,42,next,43,第三节 核酶技术,44,核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的RNA，化学本质是RNA,却具有酶的催化功能。,45,切赫(T.R.Cech)（1947-），美国人, 他独立地发现发现四膜虫转录产物rRNA

10、前体，可切除自身的413个核苷酸的内含子，使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。,Thomas R.Cech,1982,46,S.Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，留下RNA能够切割rRNA前体的5端。,1983,47,1989 Nobel Prize in Chemistry,核酶的发现改变了“所有酶都是蛋白质”的传统观念,48,有封闭 切割RNA,（1994年左右比较流行的研究工具）,49,通常由60个核苷酸左右组成； 底物部分：含有GU序列； 保守序列：13个碱基。,锤头状核酶结构示意图,50,next,51,第四节 基因敲除技术,时间：80年代末

11、功能：建立基因失活或缺失的动物模型,52,a. 胚胎干细胞（ embryonic stem cell，ES）分离培养,取自小鼠受精卵发育第4，5天的胚胎细胞 能在体外培养，保留发育的全能性,1981年，马丁埃文斯(Martin JEvans) 从正常的小鼠囊胚中分离到了ES细胞。小鼠ES细胞的分离和应用是ES细胞技术发展的里程碑。,53,同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似DNA序列间的重组，通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。,b. 同源重组技术应用,54,1985年，奥利弗史密塞斯(Oliver Smithies) 等首次报道在肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源-球蛋白基因间的同源重组。,55,1988年，卡佩基安德等发展了一种称为“正负筛选”的策略，将胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打靶载体的外侧，作为筛选的负性标记。这比单用阳性筛选正确克隆富集的倍数高310倍，真正使得同源重组技术得以应用。,马里奥卡佩基安德(Mario RCapechiand),丙氧鸟苷,56,Martin Evans 马丁埃文斯,Mario