PCR技术及其应用.ppt

1、PCR技术及其应用，分子生物学和临床，中山大学发表：杨中汉()，目录，PCR概念PCR技术的PCR原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用，聚合酶链反应(PCR ) polymerase : d 基因组DNA，引物，DNA聚合酶，DNA片段的体外扩增，PCR技术的制作，Kary B. Mullis (美) 1983年，Mullis发明了PCR技术，实现了Khorana的构想。 1988年Saiki等人将耐热DNA聚合酶(Taq )引入PCR技术1989年美国Science杂志，将PCR引入10项重大科学发明的第一位，比喻1989年是PCR爆炸年，Mullis获得1993年的诺贝尔化学奖。K

2、ary B. Mullis(1944 )、三篇重要论文，theunusualoriginofthepolymerasechainreaction (scientific American，19999) 64-5 ) primer-directedenzymaticamplificationofdnawithathermostablednapolymerase (场景，1988，239 (4839 ) 3360487-91 ) methodsinenzymology生物样本、DNA片段、基因诊断、基因治疗、基因工程产品、法医学检验、人类学研究依赖于PCR技术的生成的社会需求和研究需求，基因组DN

3、A，特定的DNA片段的体外包装，、的、的、的、DNA片段的体外包装，、的、的、 DNA文库，20kb probe，放射性核素标记，转录，、DNA克隆，目标基因，载体，复制因子，宿主细胞，扩增94变性，50-65退火，XX延伸，94，55，37， Taq DNA聚合酶1988年Saiki等人把耐热DNA聚合酶(Taq )作为PCR技术，72，94，55，PCR循环，PCR技术的原理，1 PCR技术的基本原理， 无细胞分子克隆法：以微量高温变性、低温退火和中温拉伸三个阶段为一个循环，一个循环使特异段的基因拷贝数倍增，一般样品经过30个循环，最终使基因增加数百万倍。 扩增了特异段的DNA带。 体内D

4、NA的复制、复习、DNA的改性和复原性、加热或强酸、碱性作用可以切断DNA双螺旋的氢键，解离双链，形成单链DNA，这称为DNA的改性。 解除改性条件后，改性的单链再结合形成双链，其原有特性和活性恢复。 这也称为DNA复原性，也称为退火。 PCR放大原理、引物放大原理、放大原理、放大原理、放大原理、放大原理、放大原理。、引物设定订正的最大原则是最大限度地提高放大效率和特异性，同时尽量减少非特异性的放大。、引物设定修订： (1)数组位于高度维护区，与非放大区没有相同数组。 (2)底漆长度优选为15-40 bp。 (3)碱尽量随机分布，G C占50-60%。 (4)避免引物内部形成二次结构。 (5)

5、两引物之间应无互补序列。 (6)引物的3端为重要碱基的5端没有严格的限制。、3、5、3、5、限制酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记，3 )操作简单，PCR扩增法可以用电泳法检测在几小时内1g基因组DNA中仅含有几个拷贝的模板序列。 常规的DNA扩增法是分子克隆法，首先构建含有目标基因的载体，将其导入细胞进行扩增，再用同位素探针进行筛选。 该方法经过DNA内切、连接、转化、培养等相关过程，操作复杂，一般需要几周时间。 提取目标基因、载体、复制因子、宿主细胞、扩增、目标基因、载体、复制因子、宿主细胞、扩增、DNA分子，这样反复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温拉伸的3阶段为1个循环， 每

6、个循环将奇异区间的基因拷贝数扩增一倍，一般样品经过30个循环，最终将基因扩增数百万倍。 电泳放大产物，用溴化乙锭染色，紫外灯照射下肉眼可以看到放大特异区域的DNA带。 总体积50-100 l缓冲液dNTP原料引物DNA分子印迹Taq酶DNA聚合酶，1反应体系，PCR技术的基本过程(1)，印迹DNA dNTP引物Buffer，预改性，印迹dnadna 94oc5， 2基本工艺，PCR技术的基本工艺(2)，Taq酶模板DNA dNTP引物Buffer，回旋仪，94 55 72，Taq酶模板DNA dNTP引物Buffer，72 57 min蛋白酶，核酸酶，DNA 一般的100ng DNA模板/10

7、0L。 铸模浓度过高会导致反应的非特异性增加。 3 PCR反应条件、(2)引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过高时，容易导致模板与引物的不匹配，反应特异性降低。 (3)Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l酶量的增加使反应特性降低。 酶量过少会影响反应产量。 (4)dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度，4种dNTP浓度相等时，容易引入错误的碱，浓度过低时，降低反应产量的dNTP与Mg2结合，降低游离的Mg2浓度，影响DNA聚合酶的活性。 (5) Mg2、Mg2是DNA聚合酶的活化剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。

8、Mg2浓度过低会失去Taq酶活性，PCR产量下降Mg2过高会影响反应特异性。 由于Mg2与负离子结合，反应体系中的dNTP、EDTA等浓度影响反应中游离的Mg2浓度。 2 )将循环残奥仪改性双链DNA解链为单链94OC的2030秒(2)退火温度，取决于引物长度和GC含量。 提高温度可以减少引物和模板的非特异性结合；降低温度可以提高反应灵敏度。 (3)拉伸70-75，一般72拉伸时间由放大片段的长度决定(4)循环数主要由孔版DNA的浓度决定，一般25-35次的次数过多：放大效率降低错误混入率增加，古典循环残奥计(500bp以内)，9430s5545s72 分别称为限制引物和非限制引物，其最佳比例

9、一般为0.010.5M，限制引物的绝对量很重要。 用途：核酸序列测定模板制备杂交探针基因组DNA结构功能研究，PCR类型扩展未知序列后可以进行分析，例如搜索与已知DNA片段相邻的序列，克隆仅知道部分序列的全长cDNA，插入扩增基因库DNA； 创建基因组阶跃迁移库。已知序列，未知序列，未知序列，已知序列，未知序列，未知序列，限制酶，限制酶，限制酶，限制酶，限制酶，限制酶，限制酶，限制酶，限制酶， 脂肪酶、电泳、引物区域缺失载体、c :正常人DMD基因外显子的一般放大形式、多重PCR检测DMD基因缺失、4 ) LP-PCR (标签主)、同位素特别适用于大量临床标本的基因诊断可同时检测多个基因成分、

10、病毒1、病毒2、病毒3、病毒4、标记引物、观察、PCR产物、5 )锚点PCR(anchored PCR，A-PCR )、(固定化PCR )、VH、CH1、CH1、CH2、CH2、CH3、CH3锚点PCR首先合成第一链cDNA，然后添加同质尾点(polydG )，并与同质尾点对的3锚点引物(带限制内接位点的polydC )一起进行poly 检测探针信号，将可用于制备基因芯片的完整细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目标片段，在不破坏细胞的情况下，利用特定的检测手段检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂层或残奥翅包埋组织切片在单一细胞中扩张。 可以进行细胞内定位。 适合检测病理切片中含量少的靶序

11、列，原位PCR的作用过去为鉴定细胞内特异序列采用原位杂交(ISH )，但各细胞中目的片段拷贝数少于10时，该方法灵敏度明显降低。 标准PCR可扩增细胞内单个拷贝的序列，灵敏度高，但不能与细胞形态学研究结合。 ISPCR将两者结合，成为细胞学诊断中的新检测技术。 该方法在细胞内病毒感染检测、细胞内基因重排、细胞内RNA表达产物分析等方面起一定作用。 对检测细胞的潜在感染也有重要意义。 操作步骤1 .细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理，一般的PCR试剂(包括引物和Taq酶)可进入PCR扩增细胞内的目的片段3 .原位杂交检测扩增产物，a .阳性对照，b .阴性对照， c.insitu检查mR

12、NA表达PCR放大，基因，mRNA，蛋白质多肽链，9 )荧光定量PCR(real-time PCR )，通过荧光染料和荧光标记的特异探针标记追踪PCR产物，荧光定量PCR修正光定量PCR修正是激发光源和荧光荧光标记、荧光定量PCR标记方法内掺杂染料SYBR Green I序列特异性探针taqmanmolecularbeaconsdualprobes (fret )引物特异性探针Amplifluor (Intergen )， sybr-greeen Taqman探针的3端q荧光分子能够吸收来自5端r荧光分子的荧光，因此，通常，该探针只能检测来自5端荧光分子的荧光，只能检测3端荧光分子的荧光信号，但如果溶液中存在PCR产物(模板)，则探针产生适合核酸外切酶活