改良LORRY法测蛋白质含量

1、实验室规则,实验要求 实验室安全： 实验服、口罩、手套 试剂和仪器的使用 禁止大声喧哗，保持实验环境的安静 实验室卫生 实验分组,实验报告格式,实验名称,姓名： 班级： 学号：,实验原理：,实验目的：,实验步骤：文字简洁，尽可能采用图表,实验结果：原始数据、计算过程、结论,实验讨论：结果分析、实验注意事项,实验日期： 同组人员：,总分100 ：50%为实验理论（闭卷） 50%为实验技能操作及平时 平时（包括实验报告和平时表现）,实验课的考核,？ ？,实验安排,12临床药理、医学检验、药学,13护理班,13生工、药贸,实验四：谷丙转氨酶活性测定和竞争性抑制（22&7）,实验五：质粒DNA的提取与

2、电泳（27）,实验一：改良Lowry氏法测定蛋白质浓度（1）,实验二：乙酸纤维素薄膜电泳和凝胶柱层析（14&13）,实验三：血清甘油三酯含量测定（26）,试验六：聚合酶链式反应（28）,实验七：血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（15）,一、玻璃仪器的常规清洗（P2-3）,实 验基本操作,清洗剂刷洗 自来水冲洗（至少5遍） 蒸馏水冲洗（2-3次） 干燥与放置,二、吸量管的使用（P3-4）,选、吸、平、减、吹,三、试剂瓶、吸量管、试管的放置,试剂瓶用后放回原处、标签面向同一方向 吸量管箭头朝下放置，以免倒流 空置干净试管倒扣放在试管架上,四、分光光度计的原理（P11）,光源,I0,I,单色器,样品池,狭

3、缝,检测系统,T = I/I0， A = - lg T,1、A1/A2= c1/c2 2、标准曲线法,Lambert-Beer 定律,A= KcL,1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热2030min 2. 1档（空白管），T模式调100%，显示“Blank”、“100” 3. 拉杆拉至1.5档，T模式调0%，显示“0.00” 4. 切换到A模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度 5. 使用完毕后，置于休息档（1.5档）,拉杆，1-4档,样品池,读数,波长,五、分光光度计的使用,1档，空白对照，A=0，T=100%,1.5档，隔板，A=+，T=0%,2档，样品1，A=？,3档，样品3

4、，A=？,4档，样品4，A=？,1、分清光面、毛面 手只可接触毛面，光线须从光面通过 2、用溶液润洗2-3次，装至2/3至4/5体积 3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面 4、从低到高依次测量，不需清洗比色杯 5、蒸馏水冲洗3-5次，擦干，倒扣放置,毛面,光面,六、比色皿的使用,改良Lowry氏法测定 蛋白质含量,实 验 一,P28,实 验 目 的,1、学习改良Lowry氏法测定蛋白质含量 的原理及方法 2、了解标准曲线在物质定量测定中的 应用及绘制要点,实验原理,凯氏定氮法 16% 紫外吸收 280nm 呈色反应,OH-,Pr-Cu2+ 螯合物 (紫红色),酚试剂,钼蓝-钨蓝混合物 (蓝色，深浅与蛋白

5、含量呈正比),（双缩脲反应）,改良Lowry法,费时较长，而且要精确控制操作时间。 显色程度与时间有关。 专一性较差，干扰物质较多。,灵敏度高 双缩脲法的检出限为 0.21.7 mg/ml， 而本法的检出限为0.0150.110 mg/ml。,优 点,缺 点,实 验 步 骤,1、标准曲线的绘制和实测样本浓度的求得,实 验 结 果,0 x1 x2 x3 x4,Y3,OD650,蛋白质量（mg）/蛋白浓度（mg/ml）,Y2,Y1,样品吸光度,样品浓度,2、浓度换算,样品体积,实测蛋白质量,待测蛋白浓度（g/L）=,实测蛋白浓度,稀释倍数,待测蛋白浓度（g/L）=,稀释倍数,注意 终体积相同的前提下，可以用质量代表浓度 例如：1号管中，蛋白质量为0.02mg，而其终浓度为0.004mg/ml 注意溶液的稀释倍数 例如：若以浓度为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白浓度为0.02mg/ml, 则待测蛋白浓度= 0.02mg/ml x 5 x 1000=100mg/ml 若以质量为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白质量为0.1mg, 则待测蛋白浓度= (0.1mg/1ml) x 1000=100mg/ml,注