ECOTOX05-03.ppt

1、化学物相互作用 两种或以上化学物同时或先后作用于生物体，并相互影响其毒性作用，称相互作用。 相互作用大致分为联合作用和其它作用： I 联合作用 (a) 简单加和作用 (additivity) 化学结构/性质近似的化合物或作用于同一器官系统或作用机理相似的化合物)； (b) 协同作用 (synergism) 毒性增加/增强； (c) 增强作用 (potentiation) 本身无毒性，与其它化学物同时给予则导致毒性增强；,(d) 独立作用 (independent joint，没有相互作用)； (e) 拮抗作用 (antagonism，致使毒性效应降低)。 拮抗作用进一步划分为： (a) 功能拮

2、抗 (functional antagonism) 作用于同一生理机能，但作用相反，结果使生理功能仍能维持)； (b) 化学拮抗 (chemical antagonism) 化学物反应导致毒性下降； (c) 转运/配置拮抗 (dispositional antagonism) 干扰或改变另一化学物的吸收、代谢、分布和排泄，是靶标浓度降低或排泄增加使得毒性降低； (d) 受体拮抗 (receptor antagonism) 与同一受体结合，毒性低于各自结合的毒性。,II 其它作用 (a) 竞争效应 (competitive) 导致污染进入数量和几率降低或竞争结合点位； (b) 保护效应 (pro

3、tective) 掩盖/掩蔽作用，改变毒性和生态系统组分接触行为； (c) 抑制效应 (inhibitory) 作用导致生物活性下降，难以进入系统产生危害。 毒能 (potency) 外源物诱发机体强烈生物效应的能力，即产生毒性效应的剂量范围。,毒效 (efficacy) 外源物在理想条件下可以达到的对生物体的最大影响，即：剂量响应曲线中生物体“响应”的上限。毒能与毒效主要用于比较化学物对生物体影响的能力和特点。 最大可接受毒性浓度 (maximum acceptable toxic concentration, MATC) 指无观察效应浓度与最低观察效应浓度的几何平均值。是对低于致死剂量(慢

4、性)生物法的一种度量。 无观察效应浓度 (no observed effect concentration/level, NOEC/NOEL) 指响应与对照控制组没有显著差别所对应的化学品最高浓度。,基本概念,注意：因检测结果的变异性较大，因此NOEC不宜用作无效应浓度(NEC)的估值；而EC50和其它点估计值则相对NOEC更加一致，更为可靠，可用以比较不同检测的结果。 最低观察效应浓度 (lowest observed effect concentration or level, LOEC or LOEL) 指响应与对照控制组有明显差别所对应的化学品最低浓度。 百分抑制浓度 (percent

5、age inhibition concentration, ICp) 表述分级的低于致死剂量的结果。例如：造成孵化率或生长率30%抑制作用，可表述为IC30。 急慢性比率 (acutechronic ratio, ACR) 代表一种在缺少更多合适数据条件下估算慢性毒性的粗略方法：ACR = 急性LC50/MATC,基本概念,急性毒性 指机体一次或在24小时内多次接触外来化合物之后引发的中毒效应，表现在不同水平上的损害甚至死亡。 基于急性毒性设计的试验方法称为急性毒性试验，是毒性试验的第一步。 目的主要有： 确定对实验动物的LD50或LC50有效剂量，以及某种效应的急性阈剂量； 阐明急性毒性的剂

6、量响应关系和特征； 机体内生物转运和生物转化的动力学变化； 为进一步的亚急性、慢性和特殊毒性试验提供依据。,化学物急性作用带(acute effect zone, Zac) 常用的以补充LD50不足的参数。一般指毒性上限与下限的比值，即死亡剂量与最低毒作用剂量之间的剂量范围。 其大小反映急性阈剂量(Limac)距离LD50的宽窄，愈大表明引起急性死亡的危险性愈小。 Zac = LD50/Limac 目前有人主张使用： Zac = LD84/LD16 因两者之间正好是致死剂量响应曲线的直线部分，也是LD5016数值，或者用剂量死亡曲线的概率单位的斜率表示。,亚急性毒性作用 实验动物连续多日接触较

7、大剂量的外来化合物所出现的中毒效应。较大剂量指小于急性LD50的剂量。 主要用于探讨亚急性毒性的阈剂量和亚急性未观察到毒效应的剂量水平(NOEL)，为慢性试验提供接触剂量和观察指标。 亚急性效应评价取决于两个重要因素： 生理和行为参数的选择，用于预测生态显著性响应； 亚致死响应的实验测定。 亚致死效应 指因摄食干扰、非正常生长或行为、更大的易被捕食性、更低的拓殖能力、或其它间接原因而被破坏的生理或行为活动，但尚未造成即时的死亡，尽管死亡可能会在以后发生。,亚致死效应不仅会导致各自物种种群的改变，而且会导致物种组成和多样性的变化。 亚致死效应特点： (1) 通过在某一组织或发育水平上施加污染物压

8、迫而引发； (2) 通过在发育的后期阶段结构或功能发生改变而加以辨识； (3) 在发育的深入阶段较低的存活潜力充分表明其显著性。,亚急性毒性研究中的参数,亚致死响应根据对有机体的效应可划分为不同类型 (1) 生理的； (2) 生化/细胞结构； (3) 行为； (4) 生殖。 毒性检测方法 (1) 可以利用现场/野外实验和调查； (2) 也可以利用模型生态系统测试或实验室生物方法进行。 实验室中的实验条件可以控制，受试物种的响应在很大程度上可以观察或监测。,受试物种的响应可大致分为： (1) 急性效应(acute effect) 有机体响应严重，足以造成通常在96小时以内的快速响应，通常用96h

9、 LC50； (2) 亚急性效应(sub-acute effect) 有机体响应严重程度低于类型(1)，而且时间相对较长； (3) 慢性效应(chronic effect) 对某一连续条件，有机体响应至少保持其生命周期的10%。,基本概念,慢性毒性 (chronic toxicity) 指以低剂量外来化合物长期暴露，观察其对实验动物产生的毒性效应。用以确定外来化合物的毒性下限，即长期接触引起机体危害的阈剂量和无作用剂量，为危险性评价和制定接触的安全限量标准提供毒理学依据。 慢性毒性作用带(chronic toxicity zone, Zch) 指急性毒性阈浓度(剂量)与慢性毒性阈浓度(剂量)的

10、比值，是评价慢性中毒危险性的指标。 Zch = Limac/Limch 慢性毒作用带愈宽，表明该物质引起慢性中毒的潜在危险性愈大。,特殊毒性试验如联合毒性测量，常包括： (1) 独立作用(independent) 相互不干扰； (2) 相加作用(additive) 毒效应强度表现为简单加和关系； (3) 协同作用(synergistic)或增强作用(potentiation) 毒效应大于各自毒效应之和； (4) 拮抗作用(antagonistic) 干扰、削弱毒效应，低于各自单独作用时的毒效应。 行为生态毒理(behavioral ecotoxicology) 机体接触外来化合物后，形成内源性

11、刺激或损伤所引起的机体各系统、尤其是神经系统，反应总和的最终表达。主要采用神经生理学和心理学调查方法，以及神经生物化学方法。,行为有毒物的分类方案,行为效应的相对风险水平： 最小， 低， 中， 高,累计百分死亡率(mortality)，百分死亡频率(frequency)及剂量关系,毒性调查基础是化学品暴露/接触与毒性关系,高斯曲线(钟形)反映正态分布的种群响应。 体现更敏感个体的早期死亡和最耐受有机体的存活延长,LC50 代表种群的平均响应,10,累计百分死亡率(粗实线),50,百分死亡频率(粗虚线),10,剂量 (化学浓度对数比例),正态分布,均值标准偏差,种群包含比例%,均值1x标准偏差,

12、68.3,均值2x标准偏差,95.5,均值3x标准偏差,99.7,剂量反应曲线关系,无论剂量反应曲线的类型如何，总体趋势通常表现为剂量增加，反应率越高，呈现渐升曲线。只有当毒性作用表现为抑制性的量反应时，剂量增加，观察值降低，呈现渐降曲线。当试验结果表现为上述情形时，称为存在剂量反应关系。确定关系的可靠方法之一是进行趋势分析。,正规/正态等价偏差 NED,正规偏差值/概率单位PROBIT,剂量 (对数比例),0,1,2,1,2,3,4,5,6,7,10,2.3,15.9,50.0,84.3,97.8,百分响应(概率比例) Probability,附注：NED指Normal Equivalent

13、 Deviation (数值上等价于标准偏差),对数剂量概率响应关系建立正规偏差值,剂量概念： 有时指暴露媒介中对化学物浓度和总暴露时间的确定。实际上，这两个参数提供对暴露/接触(exposure，与现场情况具有很大相关性)的一种量度，而非剂量。 剂量响应/反应关系 基于室内实验的生物描述方法，实际上，经常测定的是暴露响应/反应关系。,NED单位加5以避免负值,局量子(quantal)的剂量响应现象通常是正态分布 百分比响应可转化为均值偏差单位或正规/正态等价偏差(NED),毒性百分率与概率单位换算表,具有相同LC50不同斜率函数的化合物A和B的剂量响应,死亡率 %,50,暴露浓度 (ug/L

14、),A,B,10,正规偏差值/概率单位,经正规偏差值/概率单位变换的响应曲线 计算斜率可提供有关毒性行为的附加信息,较陡的斜率意味着化学物A较高的吸收速率，以及在相对较窄的浓度范围内响应快速增加,平缓的斜率意味着化学物B较慢的吸收速率，或可能是较高的排泄或去毒作用,5,毒性响应曲线,死亡,不可逆伤害,可逆伤害,自稳状态,(a),(b),C1,C2,C3,C4,安全临界值,常态,伤害增强,毒性响应,恒定暴露时间内的毒物浓度,曲线(a)： 低浓度下表现为生命必需物质效应。,曲线(b)： 表现为生命非必需物质的效应。,基本和非基本元素浓度与性能(生长,繁殖,存活)关系,缺乏,适宜,毒害,浓度Ce,性

15、能,基本需要窗口,基本元素,无效应,毒害,浓度Cne,性能,基本需要窗口,非基本元素,d,d：当分析技术灵敏度提高时，也许会观察到 非基本元素在超痕量水平上可能出现的缺乏 效应。,假设的剂量响应关系曲线,剂量,响应,a,b,c,临界型,准临界型,累积型,线性,饱和,临界型和准临界型曲线来源于 一个逐渐饱和的解毒作用体系； 或者一种诱导的活化途径； 或者不同的修复过程。 当曲线呈现外凸形状时 观察到的剂量效应关系如果向下(低剂量)外推，常为线性，但这可能是错误的结果； 而反向倒推则可能在高剂量水平时从剂量效应曲线获得饱和效应； 在这种情形下，低剂量阶段曲线具有较陡的斜率，高剂量水平时则趋于平缓。

16、 饱和曲线可能反映几种机理 一种诱导解毒作用途径； 一种逐渐饱和的活化途径； 不同的修复过程。,污染物浓度与机体响应的假定关系,线性响应,非线性响应,响应,刺激(剂量),非检测响应 (不确定区域),测定亚致死响应,致死,测定亚致死响应临界值,初始致死临界值,50%测试机体致死浓度或剂量,0.0010.1 LC50/LD50,(LC50/LD50),暴露时间(小时),同一剂量(急性)响应数据的不同表达方式,指示LC50如何在较长的暴露时间条件下逐渐变得较低，不过随着测试时间的延长，LC50降低强化的趋势被削弱。,有毒物浓度增加,50,死亡率%,5 ug/L,10 ug/L,20 ug/L,50

17、ug/L,100 ug/L,死亡率%,暴露浓度(ug/L),50,暴露时间增加,8h,24h,48h,96h,120h,数据变换方法： (i) 正规偏差(Probit)/概率单位变换； (ii) Logistic函数(角弧度反正弦变换 结合滑动平均内插)； (iii) 改进的非参数SpearmanKarber方法。,暴露时间与半致死浓度毒性曲线,暴露时间 (分钟),导致50%水生生物死亡率浓度 (mg/L),临界/初始LC50 (低于此浓度则短期内无致死性),24h LC50,趋向于时间坐标的渐近线,临界/初始LC50经常用于建立暴露在有毒物 慢性毒性水平下，自然生物种群的风险基准,有毒化学物

18、浓度与暴露时间的关系,50,20,100,10,1,2,5,10,浓度 (mg/L, ppm),时间 (小时),毒性剂量由暴露时间和浓度乘积(矩形面积)近似表示； 具有不同边界的矩形假定具有相同的毒性程度。,中位致死时间与剂量关系：初始LC50出处,初始的LC50,有毒物浓度,中位致死时间 (LT50),存在某一点致使更长暴露时间 不会进一步造成LC50任何改变,渐近线,绘制方法过程： 在一固定的暴露浓度，绘制一系列经选定的生存时间与相应的存活百分数关系图； 然后对其它暴露浓度绘制类似关系图，以获得中位存活时段 (中位响应时段LT50，LT50可用于指示急性毒性作用时间过程，但不能用于比较急性

19、毒性高低)； 进一步绘制中位暴露时间与化学物浓度关系图。,LC50/LD50的确定,X时段后的死亡率,化学物浓度,X时段的LC50,Y时段后的死亡率,化学物浓度,Y时段的LC50,X,Y,暴露时段,中位致死浓度 (LC50),确定步骤： (a) 在固定的暴露时段，绘制暴露浓度与致死百分数的关系图； (b) 依此类推，可获得每一暴露时段的中位致死浓度； (c) 进一步绘制中位致死浓度与暴露时段的关系； (d) 最后，可推断特定时段的LC50值。,LC50/LD50的确定,LD50(LC50) 是一个统计量。受多种因素影响，如物种、品系、性别、年龄、浓度及稀释溶液性质等，因此，必需注意条件的同一性

20、。 根据死亡率剂量响应数据分布的要求， (a) 要求数据正态分布 (b) 不要求数据正态分布 其计算方法大体分为两类：,(I) 正态分布法 方法基于当剂量以对数表示、响应以频率表示时，相应地，对数剂量响应频率呈正态分布； 当频率转化为累积频率时，则响应呈“S”型曲线； 响应频率达50%时，概率单位为5。 1. 回归法 较为准确，不要求每个剂量组的物种数相等。 包括简单回归和加权回归； 2. 改进的寇氏法 要求最小剂量反应率小于0.2，而最大剂量反应率大于0.8； 要求每个剂量组的组间距呈等比或剂量对数呈等差关系，各剂量组物种数相同，中间剂量接近LD50。,3. 概率单位法(probit met

21、hod) 转换步骤包括：浓度对数化、概率单位换算、回归直线方程、纵轴概率单位为5作平行线向对数浓度横轴投影求值、卡方检验、计算标准误差和置信度。 4. 图解法 原理同概率单位法，用图解方法代替计算。 (II) 非正态分布法 1. Horn法 也称平均移动内插法(interpolation)或者剂量递增法。 推荐使用四个剂量组，每组动物数目相等； 或提出两种剂量系列，组距不同。 其它相似的方法如：直线(straight line)内插法,2. 平均数法 又称阶梯法或称“上下”法。按序贯设计，不预先将试验物种分组，而是先以某一剂量试验： 若死亡，则用一较少剂量试验，若仍死亡，继续减量试验； 若出现

22、存活，则再以较大的一个剂量试验，逐步试验进行逼进。 平均数方法只适用于快速发生中毒反应及死亡的化学物，凡迟发性死亡的化学物均不适用。 3. Weils表移动法 基于递增剂量法计算，查Weils表找出有关参数。,计算LD50的两类常用方法,此外，能够计算LDp的曲线拟合方法包括：极大似然法、加权最小二乘法、计算器拟合法、加权近似法、简化概率法，后两种方法仅适用于概率单位变换。,LC50(EC50)的优点及缺陷,由于不同试验物种品系、外源化合物、机体接触方式和途径等均可影响外源化合物的LC50，因此，必需注明试验的物种种类和接触途径及性别等。 优点 在常用的毒性参数中，以LC50最为敏感和稳定，是

23、毒性测试中最广泛采用的指标； 数值愈大毒性愈小，反之则愈大； 与其它常用的毒性参数相比，LC50是根据试验数据，经数理统计获得，具有较高的精确性和较小的抽样误差，并可计算出一定概率的置信区间。 主要缺陷 在于仅关注曲线上统计结果更加稳健的中部，置信区间对比平均值相对较窄；,曲线两端潜在的有用信息易丢失，尤其是在低值一端，因为令人感兴趣的是化学物引发毒性的最低浓度，即所谓门限/阈值浓度(threshold)； LC50可用于比较毒物之间的毒性大小，但不能直接指示安全剂量。,正规偏差值 Probit,浓度,5,外推的LC0,96 h,72 h,48 h,24 h,0,A,1/T,利用不同时间上剂量

24、响应数据得到的回归方程来确定LC0 ( LC0.01),USEPA利用三维方法(剂量响应时间)推导无效应浓度(NEC) NEC的操作定义为：从正规/正态偏差曲线上t 处的LC0.01。 包括两步分离的回归过程： (1) 首先确定各时间间隔的LC0(图A)； (2) 然后绘制LC0数据与时间倒数的关系，并外推至假设的极限暴露时间(图B)。,绘制LC0 对1/T图形，以确定LC0 在t 处,B,截距 (a) LC0,LC0 浓度,0.01,0.02,0.03,利用回归技术由急性毒性生物法外推时间、浓度、死亡率以估计长期效应,低剂量外推模式示意图,0,可观察范围,外推剂量范围,剂量,反应,出现多种可

25、能情况，存在不确定性,注意点： 不同的外推模式也许能很好地适于所观察到的资料，但在低剂量时，可能导致风险，结果会存在很大差异。 在缺少充分资料进行对比时，推荐使用线性多阶段模式(LMS)，一般认为此模式得出的风险的合理上限与一些癌症形成机理一致。,用于外推低剂量的数学模型,外推低剂量的数学模型,威布尔模型 假设效应发生的点概率是剂量对数的函数并呈威布尔分布。 其中，P(d)为某暴露剂量(d)下，预期效应的发生概率；d为暴露剂量；和m为曲线拟合参数，均大于0。 分别为1，1和1时，低剂量下的剂量响应关系曲线分别为线形，次线形和超线形。 适用于在实验剂量范围内的剂量反应关系，曲线特征为低、中剂量阶

26、段为线形，高剂量阶段为向下弯曲形。,一次打击模型 假定靶细胞在一定时间内受到一次生物学有效剂量单位打击后，即可引发肿瘤，而肿瘤发生数目与总剂量有关而与暴露类型无关。 低剂量下剂量响应关系曲线呈线形，该模型估计的危险度最高，即最为保守。 多次打击模型 是一次打击模型的扩展。假设靶细胞须经至少k 1次打击后才可诱发一次反应。 u为预测的打击次数。k = 1，1，1时分别为线形，超线形和次线形。 其适用的实验剂量范围内的剂量响应关系曲线特征同威布尔模型。,与多阶段模型相比，应用关系曲线上低剂量阶段呈线形、高剂量阶段呈向上弯曲形的数据时有局限性。 多阶段模型 假设癌症发生是多个不同随机过程发生的生物学

27、过程的结果。 当i 0，= 0时，关系曲线分别为线形和亚线形(高剂量段为向上弯曲)。 肿瘤出现时间模型 剂量所导致的某种迟发效应的点频率，作为出现效应所需时间的对数函数，其分布成正态分布。 若发生细胞转化的时间遵从ArmitageDoll多阶段模型，则肿瘤出现的时间概率如公式所示。 w表示肿瘤形成潜伏期。适用于估计如暴露只占生命周期一段时间等情况下的致癌危险度。,生理药代谢动力学模型 属于机理性模型。通过综合分析影响化学物在体内转运和转化的因素，预测化学物在靶组织或器官的生物有效剂量。 包括分配系数、生理常数和生化常数三类参数。,剂量响应的数学模型,统计考虑,统计的作用 假设检验过程 确定两个

28、带有某些预制置信水平的种群的差异； 自然界中的预测作用 一个或多个自变量对一个或多个因变量的影响。 调整百分响应 调整百分响应 (检测组百分响应控制组百分响应)/(100控制组百分响应)x100 数据分布检验和分析方法 (1) 通常，低于致死剂量(慢性毒性)的数据是： 非正态分布：可由协方差或SharpiroWilks检验确定； 或非均质的：可由Bartlett检验。,在这种条件下，需要用非参数(non-parametric approach)过程，如： Steel多重秩比较检验：适于相等大小的重复情形； 或Wilcoxon秩和检验：适于不等大小重复情形。 (2) 正态分布的数据 可以用Dun

29、nett检验进行分析。 某些情况下，非正态分布的数据可以用具有减少数据点差异作用的数学方法变换为正态分布，如反正弦变换。 (3) 常用的数理统计软件：SAS(Statistical analysis software)，SPSS(Statistical program for social sciences)，Statistica等。,(A) 时间响应(死亡时间)模型(Time-Response, TimetoDeath Models) 当前，逐渐兴起的替代剂量响应方法的是时间响应或死亡时间模型。 死亡率测试遵循一个时段，典型地，它延伸超出急性生物法的持续时间，有些类似于前述的图示方法，不同的

30、是其时间尺度囊括生物体绝大部分或全部的生命周期。 另外，有关数据可构成种群结构的人口统计学模型(Demographic Model)、生存分析(Survival Analysis)和失败/故障分析(Failure Analysis)的基础。,时间响应(死亡时间)模型,反应时间毒性资料的剂量响应模型,累积死亡分布函数F(t)， 在t = 0处，F(t) = 0； 在100死亡率处，F(t) = 1。 反之，生存函数S(t)：S(t) 1 F(t)； 危害函数h(t)： 描述在时间t百分比生存概率，数学上与生存函数相关： h(t) = dlogS(t)/dt = 1/S(t) dS(t)/dt 危害函数用于： 确定毒性是否随时间稳定， 或是否随暴露继续而加速或减速。,(B) 通用线性模型(General Linear Models, GLM) 由于“S”形耐受分布曲线(累计百分死亡率)对于某些生物，尤其是微生物毒性检测不适用，因其响应典型地表现为一连续变量，因而更适合使用GL