分子生物学检验技术第8章.ppt

1、第八章 核酸分子杂交技术,武汉大学 郑 芳,第八章 核酸分子杂交技术,第二节 探针的设计与标记,第三节 分子杂交,第四节 核酸分子杂交技术的应用,第一节 核酸杂交的基本原理与分类,第一节核酸杂交基本原理与分类,第一节 核酸杂交的基本原理与分类,二、杂交的基本分类,一、核酸分子杂交的基本原理,第一节 核酸杂交的基本原理与分类,单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交 利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术,变性,复性,一、核酸分子杂交的基本原理,DNA加热变性,DNA冷却复性,DNA/RNA杂交,一、核酸分子杂交的基本原理,二、

2、杂交的基本分类,（一）液相杂交 （二）固相杂交 （三）原位杂交 （四）基因芯片技术,点杂交/狭缝杂交 菌落杂交 Northern 杂交 Southern杂交,MASA液态芯片,MASA技术的原理是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力,二、杂交的基本分类,二、杂交的基本分类,二、杂交的基本分类,二、杂交的基本分类,二、杂交的基本分类,二、杂交的基本分类,二、杂交的基本分类,2.Southern blot,3.Northern blot,4.点杂交和狭缝杂交,5.荧光原位杂交,6.基因芯片,1.菌落杂交,1.菌落杂交,二、杂交的基本分类,2.Southern blot,3

3、.Northern印迹杂交,二、杂交的基本分类,4.点杂交和狭缝杂交,DNA样品点到滤膜上,1 变性 2 中和 3 固定DNA,4 与标记探针杂交 5 洗脱与显影,探针DNA,探针标记,变性,将探针加到固定的DNA上,二、杂交的基本分类,5.荧光原位杂交,二、杂交的基本分类,6.基因芯片,二、杂交的基本分类,第二节 探针的设计与标记,第二节 探针的设计与标记,（二）标记方法,（一）探针种类的选择,（一）探针种类的选择,DNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,一、设计原理,一、设计原理,（二）标记方法 1.探针标记物的选择 放射性标记 非放射性标记,一、设计原理,2.探针标记方法的选择 随机引物标

4、记 DNA缺口平移标记 全程RNA探针标记 化学法全程标记 3末端标记 5末端标记,一、设计原理,一、设计原理,DNaseDNA聚合酶 （53核酸外切酶活性）,DNA聚合酶（53核酸外切酶活性 53 聚合酶活性）3dNTP1dNTP#,DNaseDNA聚合酶（53核酸外切酶活性53 聚合酶活性）,模板DNA,切开模板DNA形成一到几个碱基的缺口,掺入标记基团,缺口平移,DNA缺口平移标记,一、设计原理,在处酶切,在处酶切,从T7启动子转录,从SP6启动子转录,全程RNA探针标记,一、设计原理,化学法全程标记,与地高辛标记的探针杂交,加入与碱性磷酸酶结合的 抗地高辛抗体,加入 底物,BCIP/

5、NBT,CSPD,一、设计原理,末端标记,3-末端标记,5,3,3,5,5末端突出的DNA,5,5,3,3,3末端标记的DNA,完整双链DNA,KlenowDNA聚合酶 32pdNTP,变性,32p末端标记的 单链DNA探针,第三节 分子杂交,一、核酸分子与固相介质的结合,第三节 分子杂交,二、杂交,三、信号检测,紫外交联仪进行核酸固定,第三节 分子杂交,一、核酸分子与固相介质的结合,1.支持介质的类型和性质 2.核酸分子的转移 3.核酸的固定,二、杂交,1.预杂交 2.杂交 3.洗脱,杂交的基本程序,预杂交： 滤膜在68C的预杂交（含鲑鱼精DNA） 溶液中水浴1h 杂交： 将变性探针加入杂交

6、溶液，在42C孵浴8h,二、杂交,二、杂交,洗脱： 滤膜浸入2SSC和0.1%SDS溶液中，室温孵浴5min，再至预热的0.1SSC和0.1% SDS中，于42C孵浴15min；随后滤膜在新配制的42C预热的0.1SSC和0.1%SDS溶液中孵浴15min；用2SSC的溶液短暂漂洗滤膜，将滤膜置于一纸巾上,三、信号检测,（二）非放射性杂化分子的检测,（一）放射自显影,（一）放射自显影 1.直接放射自显影 2.间接放射自显影,三、信号检测,三、信号检测,（二）非放射性杂化分子的检测 1.直接检测 2.间接检测 3.显色底物检测 4.化学发光底物检测 5.多探针检测,间接放射自显影,三、信号检测,

7、与地高辛标记的探针杂交,加入与碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体,加入 底物,BCIP/ NBT,CSPD,三、信号检测,第四节 核酸分子杂交技术的应用,第四节 核酸分子杂交技术的应用,二、Northern杂交技术,三、原位杂交技术,四、液相杂交技术,一、Southern杂交技术,（一）单基因遗传病的基因诊断 （二）基因突变的检测,一、 Southern杂交技术,二、Northern杂交技术,（一）RNA病毒的检测 （二）基因表达的检测,三、原位杂交技术,（一）细胞遗传学分析 （二）比较基因组杂交 （三）基因图谱绘制 （四）病原学检测,线粒体DNA的8个突变位点膜杂交结果,3256,3290,331

8、6,3394,3593,3606,3618,3688,野生型,突变型,四、液相杂交技术,Northern杂交对基因代表水平的检测,GAPDH,靶基因,病人组 对照组,四、液相杂交技术,FISH，荧光原位杂交,应用 DNA染色体分析 三体分析 染色体作图 分裂间期研究 产前诊断 CGH,Metaphase Chromosom 1, FITC Chromosom 12, TRITC Chromosom 17, FITC and TRITC,Nucleoli Chromosom 13q14, FITC Chromosom 21, TRITC,FISH显微摄影术,间期细胞核 FITC/TRITC Double Filterset 24,分裂中期和间期 FITC/TRITC/DAPI Triple Filterset 25,多种荧光数码片,Human Chromosome 5 6 Cosmid Clones by courtesy of Th. Ried,24 色荧光原位杂交或