总RNA的提取和RT-PCRPPT课件

1、.1，总RNA提取和RT-PCR，南方医学大学生物化学和分子生物学实验教学中心，2，整个RNA提取和纯化是RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR。掌握从细胞中提取总RNA的方法RT-PCR基因扩增的原理和操作方法，目的，3。实验过程，提取原理操作程序，反转录原理操作程序，总RNA提取，合成CC第一部分细胞总RNA提取，5，操作程序，1 .均质作用8000rpm离心2min收集细胞，放弃青青；放入500uL的TRIpure，用振荡器振动，进行不明显的沉淀，室温为5毫米。2.在分离阶段，在均质样品中加入0.1mL氯仿，剧烈振动15s，室温下加入2-3mi

2、n，12000g离心15min，吸入新的Ep管。3.在RNA的沉淀中加入0.5毫升异丙醇，上下颠倒混合，在室温下孵化10min，12000g离心10min，扔掉上清液，胶状沉淀引人注目。4.RNA的冲洗，加一次500微升75乙醇清洗，轻轻倒洗，12000g离心5毫升，乙醇. 5。丢弃RNA的再溶解空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uL RNase-Free处理水充分溶解。6，原理，10-5毫克RNA/细胞mRNA 3末端有20-250个聚腺苷酸(polyA)结构，可以用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离方法：伊塞硫氰酸溴化超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、氯化锂-尿

3、素法、蛋白酶K-细胞质RNA萃取法等，依塞硫氰酸酚-氯仿一步法等。目前常用的是三唑方法。7，原理：三唑的主要成分，三唑是新的总RNA提取试剂主要成分，是二硫氰酸胍和苯酚。李晟硫氰酸胍属于解毒剂，能溶解强蛋白质变性零蛋白，其主要作用是分解细胞，释放细胞中的蛋白质/核酸物质。苯酚可以有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此在三唑醇中添加8-羟基喹啉、-巯基乙醇等，抑制内源和外源RNase。8，添加氯仿离心力后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层相。去除水分，用异丙醇沉淀，RNA可以回收。用乙醇沉淀中间层，使DNA可以回收。可以用异丙醇沉淀有机相，回收蛋白质。原理，9，装置和主要试剂，1

4、.微量加合枪，灭菌超薄DEPC反应管2。TRIpure试剂3。氯仿4。异丙醇5。75乙醇6。有效变性RNase水核蛋白复合物；有效抑制内源酶；有效地从与蛋白质的混合物中分离出来。多糖含量高的样品还包括有效去除多糖杂质。键，12，RNA酶污染源，RNA酶能经受沸腾，高压灭菌等多种处理。严格控制外源性RNA酶的污染。外源性RNA酶存在于操作员的手出汗、唾液等方面，灰尘中也可能存在，会导致仪器、玻璃产品、塑料产品、电泳洞区、研究人员的手、各种试剂污染。最大限度地抑制内源性RNA酶：各种组织和细胞中含有大量内源性RNA酶。13，防止RNA酶污染的措施，所有玻璃器皿在使用前180的高温下干燥6h以上。塑

5、料器皿可在0.1水中浸泡12h以上，进行高压灭菌。有机、玻璃、传记、游泳用具等可以先用洗涤剂洗涤，用双蒸汽冲洗，干燥乙醇，然后浸泡在3%H2O2室温10min下，用0.1LLOK水冲洗，晾干。配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC处理37至12h以上。然后用高压灭菌去除残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，要用DEPC处理的无菌双蒸汽水配制，然后通过滤膜过滤细菌。操作员应戴一次性口罩、帽子、手套，并在实验中经常更换手套。RNA操作专用实验室设置、所有装置等必须是专用的。，14，RNA完整性检查，完整RNA的传记游泳可以清晰地观察到28S和18S两个皮带，28S大约是18S的两倍宽。如果两个带不明

6、显，则意味着RNA部分分解，可能的原因是污染了RNase。15、RNA分解a .组织移除后没有立即处理或冷冻。b .提取RNA的示例存储在-5到-20之间，而不是存储在-60到-70之间。c .细胞在用胰酶处理时过度。d .溶液或离心管不能用RNase去除。e .用于传记明洞的甲醛pH值低于3.5。DNA污染a .样品均匀释放时添加的测试剂量太少。样品中有机溶剂(例如乙醇、DMSO等)、强缓冲液或碱性溶液、一般问题分析、16、含有第二部分逆转录-聚合酶链反应。仪器和主要试剂、基因放大器、微量量枪、灭菌超薄PCR反应管总RNA第一链cDNA合成试剂盒(包括逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲)dNTP

7、 mix:包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP每个2MOL37 15min(反转录反应)85 5sec(逆转录酶停用反应)注意：反转录阶段为PCR仪表，19，在中执行PCR反应系统，rTaq Mix 25uL cDNA第一链产品5uL引物(正，反向引物各10uM)每个2uL H2O up to 50ul PCR反应条件如下：94 30sec55 30sec；72 30min - 30周期72 7min 4绝缘，20，从组织或细胞中提取总RNA，其中mRNA为模板，Oligo(dT)或使用随机引物的逆转录酶逆转录cDNA。然后以cDNA为模板扩增PCR，获得目的基因或检测基因表达。RT-P

8、CR将RNA检查的敏感性提高到几个数量级，使微量RNA样本分析成为可能。牙齿技术主要用于分析基因的转录产物，获取目的基因，合成cDNA探针，构建RNA高效转录系统。原理，21，RT-PCR-反转录-聚合酶链反应，逆转录酶，聚合酶，mRNA，cDNA，混合双链，PCR放大，22最佳作用温度为37。在器官逆转录过程中，不发生模板分解，获得cDNA的概率很高，适用于长cDNA链的合成。禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶：具有强大的聚合酶活性和RNA酶H活性。最佳作用温度为42。热微生物的热稳定性逆转录酶，如热病毒、热病毒：如果存在Mn2，则允许高温逆转录RNA，从而消除RNA模板的二级结构。MMLV

9、逆转录酶的RNase H-突变：商品名称为Superscript和SuperScript。牙齿酶比其他酶能把更多的RNA转换成cDNA，牙齿功能使具有次级结构的低温逆转录困难的mRNA模板合成长cDNA。选择逆转录酶，23，任意共聚物引物：通过这种方法，系统中的所有RNA分子都赋予了cDNA第一链模板，PCR引物增强过程中所需的特异性。一般用牙齿引物合成的cDNA中有96%来自rRNA。上传(dt):这是mRNA的特殊方法。大部分真核细胞mRNA都有三段涤纶(A)尾巴，因此成对的牙齿引物可以配对，只有mRNA可以转录。聚(A) RNA仅占总RNA的1 4%，因此牙齿引物合成cDNA比引物和结果

10、cDNA的数量和复杂性要低。特异性引物：引物，只生产包含目标RNA的互补序列的寡妇核苷酸，这种引物所需的cDNA，引起更奇特的PCR扩增。选择引物，24，PCR反应系统的组成，模板引物dNTP耐热DNA聚合酶(Taq酶)缓冲，25蛋白质酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类被渡边杏。一般100ng DNA范本/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。26，(2)引物引物设计：引物设计软件NTI 9.0、PRIME 5.0等长度一般小于16个核苷酸，核苷酸最多不超过30个，最佳长度为核苷酸1821个。在某些情况下，可以在第5段中添加模板和不互补的序列(如限制酶切割部位等)，以完

11、成基因克隆和其他特殊需要。两个引物之间发生互补，渡边杏。特别是在引物第3段中不可避免的情况下，3段互补碱基不能大于2个碱基。否则，很容易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”(Primer dimer)。引物内部应避免形成明显的二次结构，尤其是发夹结构。(G C)%含量：引物组成必须均匀，尽量不含相同的碱聚合物。两种引物中(G C)%的含量必须尽可能接近。引物合成：寻找专业生物公司，引物合成，27，引物特异性：引物设计和合成对PCR成功与否具有决定性作用的引物浓度：引物杨怡太低，产物杨怡减少，假阴性引物浓度高，出现促进引物诱导的非特异性产物合成。另外，引物二聚体的形成一般认为在PCR反应中，引物最

12、终浓度为0.2 1mol/l，28，(3) Taq酶从水生热菌Thermus Aquaticus (Taq)中分离的热稳定性DNA聚合酶浓度：酶浓度过低，酶浓度过高，非特异性扩增液100l反应液中，最好含有1-2.5u Taq DNA聚合酶。-20，防止冷冻储存，29，本实验中扩增的产物DNA片段长度为300bp400bp，5lPCR产物按1%琼脂糖凝胶电泳检测进行测量。利用标准DNA-marker评价扩增的特异性。阿伽罗奥斯凝胶电泳，30，实验材料，传记电泳指示剂：核酸传记影洞常用的指示剂有两种，溴酚蓝是蓝色紫色；二甲苯比蓝色，它的电荷比溴酚少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。染料：Gelview，EB传记电泳缓冲液：每个TBE阵地的DNA Marker 5000，31，溴化B (EB) :3，8-二氨基-5-乙基-6苯基吡啶溴盐)能产生非常强的荧光信号，其灵敏度高于EB，荧光强度与DNA含量成正比，在紫外线下显示绿色荧光。一般是染料，实验材料，32，分子量含有其他DNA片段，主要用途是在DNA分子凝胶电泳时，对照加成检测琼脂糖凝胶是否有问题。必须选择