4-色谱分析法.ppt

1、第四章 色谱分析法,1.气相色谱法的原理、仪器结构 2.高效液相色谱的特点，高效液相色谱仪的基本组成,一、色谱法的特点、分类和作用,1.概述 色谱法是一种分离技术，混合物最有效的分离、分析方法。,1906年，俄国植物学家 茨威特分离植物叶绿体中 色素而得名，玻璃管中装 CaCO3,石油醚溶解植物 叶绿体倒入管内，再用石 油醚做淋洗剂，结果，柱 子中被分成几个不同颜色 的谱带。,试样混合物的分离过程就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,色谱法分离基础,当流动相中携

2、带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,2.色谱法分类,(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱,液相色谱,(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。

3、 离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。,(3)其他色谱方法,薄层色谱和纸色谱： 比较简单的色谱方法,凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。 超临界色谱: CO2流动相。 高效毛细管电泳: 九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。,3.色谱法的特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体、手性异构体。 （2） 灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 （3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样

4、的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 不足之处： 被分离组分的定性较为困难。,4.分离度,分离度用来描述难分离物质对的实际分离程度。可用来作为色谱柱的分离效能指标，即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中各种因素的综合影响。色谱分离中的四种情况如图所示：,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：, 柱效较高，K(分配系数)较大,完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低，K较大,但分离的不好； K小，柱效低，分离效果更差。,二、 气相色谱法（GC法） Gas Chromatography,流动相气体（由载气带着

5、物料气体） 一般用高压气瓶供给（N2、He ) 固定相 固体 固体吸附剂 液体担体 + 固定液,（一）气相色谱仪器 gas chromatographic instruments,气相色谱仪器,气相色谱仪器,Varian3900GC-Saturn2100T,（二）气相色谱结构流程 process of gas chromatograph,1-载气钢瓶；2-减压阀；3-净化干燥管；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；7-进样针;8-色谱柱;9-热导检测器；10-放大器；11-温度控制器；12-记录仪；,载气系统,进样系统,色谱柱,检测系统,温控系统,结构流程,

6、（三）气相色谱仪主要部件 main assembly of gas chromatograph,1. 载气系统 包括气源、净化干燥管和载气流速控制；,常用的载气有：氢气、氮气、氦气； 净化干燥管：去除载气中的水、有机物等杂质（依次通过分子筛、活性炭等）； 载气流速控制：压力表、流量计、针形稳压阀，控制载气流速恒定。,2. 进样装置,进样装置：进样器+气化室； 气体进样器（六通阀）：推拉式和旋转式两种。 试样首先充满定量管，切入后，载气携带定量管中的试样气体进入分离柱；,液体进样器：,不同规格的专用注射器，填充柱色谱常用10L；毛细管色谱常用1L；新型仪器带有全自动液体进样器，清洗、润冲、取样、

7、进样、换样等过程自动完成，一次可放置数十个试样。,气化室：将液体试样瞬间气化的装置，无催化作用。,3. 色谱柱（分离柱）,色谱柱：色谱仪的核心部件。 柱材质：不锈钢管或玻璃管，内径3-6毫米。长度可根据需要确定。 柱填料：粒度为60-80或80-100目的色谱固定相。根据需要确定。 柱制备对柱效有较大影响，填料装填太紧，柱前压力大，流速慢或将柱堵死，反之空隙体积大，柱效低。,4. 检测系统,色谱仪的眼睛，通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成； 被色谱柱分离后的组分依次进入检测器，按其浓度或质量随时间的变化，转化成相应电信号，经放大后记录和显示，给出色谱图； 检测器：广普型对所有物质均有响

8、应； 专属型对特定物质有高灵敏响应； 常用的检测器：热导检测器、氢火焰离子化检测器；,温度是色谱分离条件的重要选择参数； 气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度；,5. 温度控制系统,气化室：保证液体试样瞬间气化； 检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；,分离室：准确控制分离需要的温度。当试样复杂时，分离室温度需要按一定程序控制温度变化，各组分在最佳温度下分离；,tR,t0,数据处理 从记录仪得到的色谱图,保留时间从进样到出现组分浓度极大点 （色谱峰最高点）的时间tR 在一定固定相，一定操作条件下，各组分的 t 值不一样。同一组分有同样的 t 值，可用来作定性分析。此外，

9、峰高（h）、峰面积（A）可用作定量分析。,计算 （一组分峰面积94） （ 总峰面积94） 以标准曲线来计算含量，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标。,四、高效液相色谱法（HPLC) 由经典的液相层析法发展来的，始于1906年，比气相色谱分析法早四十多年。但一度停滞，因其流动相靠自身的重力流过色谱柱，效率低，分析周期长，缺乏自动灵敏的检测装置。70年代后，又吸取气相色谱经验迅速发展。,高效液相色谱的特点： 应用范围广 只要能制成溶液的样品都能分析，不受试样挥发性的约束，对无法用气相分离的沸点高，热稳定性差，分子量大的聚合物及离子形物质，具有很大的适用性，都可用其来进行分离，分析。 高压 供液压力和进

10、样压力均很高，一般1530mpa，最高 500mpa。, 高速 由于高压，流动相在色谱柱内流速一般为110mlmin，个别达100 mlmin以上。 高效 柱效达 5000 塔板m，而分离效能很高 的GC柱效约 2000 塔板m。 灵敏度高 采用了高灵敏度检测器，如紫外检测器 的最小检测量10-9gml, 荧光检测器的 最小检测量10-11gml。,二 、高效液相色谱的类型 流动相液相 固定相 固体吸附剂 液相+支持剂 离子交换树脂 凝胶 按分离原理分： 1. 液固吸附色谱 2. 液液分配色谱 3. 离子交换色谱 4. 空间排阻色谱,（一）液相色谱仪器 high performance liq

11、uid chromatograph,液相色谱仪（2）,液相色谱仪（3）,液相色谱仪（4）,Varian1200L LC/MS,（二）流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,高效液相色谱仪的基本组成 1. 输液系统高压泵、贮液器、过滤器、梯度洗脱装置 2.进样系统进样器 3.分离系统色谱柱、恒温器 4.检测系统检测器 5.数据处理系统记录仪等,主要部件,(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点

12、之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(2)梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3) 进样装置,流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：,(4) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5) 液相色谱检测器,a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度