北大分子生物学课件 朱玉贤.ppt

1、第五章分子生物学研究法(上) DNA、RNA及蛋白质操作技术，门页：当你进入实验室时，必须像脱掉大衣一样放弃你的想象力。 实验操作有点缺乏想象力，否则你会受到事物观察的影响。 打开书的时候，要尽量展开想象中的“翅膀”。 否则，就不能走在别人面前。 基因操作主要包括DNA分子的剪接、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，这些分子原本就进入宿主细胞内，进行持续稳定的繁殖和表达。 根癌土壤农杆菌(Agrobaoterium tumefaciens )可以在感

2、染植物细胞后，将其Ti(tumor inducing )质粒上的DNA(T-DNA )插入感染细胞的基因组中，进行稳定的遗传，5. 1重组DNA 事实上，跨越这种障碍，将来自其他生物的基因进入新宿主生物细胞的能力是基因工程技术与其他生命科学技术区别开来的根本特征。 表5-1重组DNA技术史的主要事件，上世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源于工具酶的发现。 (1)限制性内切酶可识别DNA上特定的碱基序列，从该位点切开DNA分子。 最初的内切酶EcoRI是Boyer实验室于1972年发现的，特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在该部位切开，产生具有粘性末端的小片段。 图5-1中一些主

3、要的DNA内切割酶识别的序列及其酶切末端。 图5-2的DNA连接酶可以将不同的DNA片段连接在一起，在多核苷酸链中新生磷酸糖苷键的发生过程、核酸链的3-OH上一碱基5-磷酸基开始攻击，RE为随机DNA分子(假设4种碱基均匀分布在DNA中) 截断的概率是该酶识别的碱基数，重组DNA实验中常见的主要工具酶、嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、DNA和构成RNA分子的5种含氮碱基的结构式是体外受限制的核酸内截断酶和DNA利病毒、噬菌体、质粒等小分子量复制因子可作为基因导入的载体。 (二)具有基因克隆载体1、pSC101质粒载体长度9.09kb、四环素耐药基因(tetr )和EcoR

4、I、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII和SmaI种限制性核酸的大肠杆菌PSS 第一个基因克隆载体。 缺点：重型复制控制的低拷贝质粒，每个宿主细胞平均只有12个拷贝，从含有该质粒的宿主细胞中提取pSC101 DNA，产量低。 2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。 一般来说，培养基中的氨基酸枯竭，在细胞培养物中加入氯霉素抑制蛋白质的合成，宿主染色体DNA的复制被抑制，细胞的生长也停止。 松弛型质粒DNA的每个宿主细胞的ColE1质粒拷贝数为10003000个，持续复制数小时，约占细胞总DNA的50%。ColE1质粒DNA的复制开始位点控制因子之间的关系是前体R

5、NA(RNAII )的转录开始从复制开始点上游开始，RNaseH加工后需要生成555个核苷酸的引物，开始DNA合成。 由于RNA 1在RNA 2的5个末端转录方向相反，因此通过氢键对与后者相互作用，阻止RNA 2的加工，不能转换成活性引物，阻碍复制开始。 如果没有Rop蛋白，RNA 1基因就不能开始转录。 3、pBR322质粒载体由三个不同来源部分组成：第一部分来源于pSF2124质粒易位Tn3的氨苄青霉素耐药基因(AmpR )。 第2部分是来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr )第3部分是来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点(ori )。Ampr、pBR322 4.

6、36 kb，优点是具有小分子量(4363 bp )。 可携带6-8 kb的外来DNA片段，操作方便。 作为转化体的选择标记，有2种抗生素耐性基因。 有高拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可积累10003000个拷贝，重组体DNA的制备较为容易。 4、pUC质粒载体(包括4个部分) :来自pBR322质粒的复制起点(ori )氨苄青霉素耐药基因(ampr )大肠杆菌半乳糖基因(lacZ )启动子及编码肽链的DNA序列。 特别是lacZ基因位于lacZ基因的5个末端的多克隆位点(MCS )，外源基因插入破坏了lacZ基因的功能，pUC18 2.69 kb，lacZ编码半乳糖苷酶的氨基末端146个氨基

7、酸肽， IPTG (异丙基d合成的半乳糖苷酶肽与宿主细胞编码的缺陷型半乳糖苷酶互补，产生活性的半乳糖苷酶，在水解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚d半乳糖苷酶)的含X-gal培养基中优点：分子量小，复印数多。 基于pBR322构建pUC质粒载体时，只保留其中氨苄青霉素耐药基因和复制起点，其分子相当小，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。 由于rop基因缺失，pUC质粒不经氯霉素扩增时，每个细胞平均可达500700个拷贝。 pUC质粒结构有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，编码的肽链可能参与互补作用。 因此，可以用X-gal显色法实现重组体的转化体的鉴定。 具有多

8、克隆位点的MCS段可以将具有两种不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体中，如EcoRI和BamHI。 5、pGEM-3Z质粒长度为2743bp，编码氨苄青霉素耐药基因和lacZ基因。 含有2个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的附着提供了特异的识别点。 加入T7或SP6 RNA聚合酶，克隆的外源基因转录对应的mRNA。 6、穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector )是一种人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点和选择标记，可以在不同寄主细胞内生存复制的质粒载体。 这种质粒载体在外源DNA序列不同的物种(原核和真核)细胞内扩增，保证用途广泛。 7、p

9、Bluescript巨噬细胞载体pBluescript是由pUC载体衍生的巨噬细胞载体，简称pBS(/- )，现称pBluescript KS(/- )或pbluescriptsk。 SK表示多克隆位点区域的取向，即lacZ基因向SacIKpnI的方向转录(/- )表示单链噬菌体f1的复制起点的两个相反的取向。 f1()的起点表示pBluescript巨噬细胞粒载体和辅助噬细胞共同感染宿主细胞时，可以回收到lacZ基因的有意义的链DNA。 另一方面，f1(-)的起点表明，pBluesript巨噬细胞粒载体和辅助噬细胞共同感染宿主细胞时，可以回收到lacZ基因的无意义链DNA。(I )在多克隆位

10、点区域(MCS )的两侧，存在用于指导插入多克隆位点的外源基因转录的一对T3和T7噬菌体启动子(ii )单链噬菌体f1的复制起点和来自ColE1质粒的复制起点pBluescript噬菌体载体在保证辅助噬菌体有无共感染时，以不同的复制形式分别合成单链或双链DNA。 (iii )编码氨苄青霉素抗性基因的(iv)lacz基因作为转化子克隆的选择标记，可按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选巨噬细胞载体的重组子。 5. 2 DNA操作技术自5. 2. 1核酸的凝胶电泳将琼脂糖(agarose )和聚丙烯酰胺(polyacrylamide )凝胶引入核酸研究以来，分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术分

11、析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸的相互作用这种电泳分子在电场作用下的移动速度称为电泳的移动度，电场强度与电泳分子自身具有的净电荷数成正比，与片段尺寸成反比。 在生理条件下，因为核酸分子中的磷酸基离子化，DNA和RNA也被称为聚阴离子(polyanions )，在电场中向正电极的方向移动。 由于糖磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA具有大致相同量的净电荷，因此可以以相同的速度向正电极方向移动。 琼脂糖凝胶识别DNA片段的范围在0.250kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨率范围在1到1000碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质的细孔的大小，浓度越高细孔越小，其分辨率越强。 表5-3琼

12、脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶识别DNA片段的能力凝胶类型和浓度分离DNA的大小范围(bp ) 0.3%琼脂糖凝胶50 0001 000 0.7%琼脂糖凝胶20 0001 000 1.4%琼脂糖凝胶6 000300 4.0%聚丙烯酰胺1 000100 10.0%由于插入溴化乙锭分子，在紫外光照射下琼脂糖凝胶电泳中的DNA的DNA脉冲电场凝胶电泳模式图，5. 2. 2细菌转化和目标DNA分子的增殖得到外源DNA片段和载体分子重组的杂交DNA分子后，在被称为细菌转化的过程中如果不重新导入宿主细胞，就不能保证重组DNA分子的增殖。 外源DNA可以在宿主细胞中通过自身载体上的复制起始位点进行复制增殖，从而在

13、宿主细胞中长期保存，以完整的形式从细胞中分离纯化。 细菌转化(transformation )是细菌菌株通过捕获来自供体菌株的DNA使性状特征发生遗传变化的过程。 重组DNA操作过程的模式图可以提高效率，物理或化学处理受体菌，提高获得DNA的能力。 这样处理过的细胞称为受体细胞(competent cells )。 CaCl2法将快速生长期大肠杆菌放入经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜渗透性改变，易与外源DNA附着。 将这个系统转移到42进行暂时的热刺激的话，外来DNA有被细胞吸收的可能性。 将转化细胞置于选择性培养基中，筛选阳性克隆。 转化效率可达51062107个转化子/g超螺

14、旋质粒DNA。细菌转化和蓝白斑筛选、电击法的电脉冲可使细胞膜产生小凹陷，形成疏水孔。 随着跨膜电压的增加，大的疏水孔变成亲水孔，介质中的DNA进入细胞质。 将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4进行离心分离，洗涤菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液(21010/ml )放入特制的电极杯中进行电击。 得到最大转换效率时的电场强度为12.515kV/cm，时间宽度为4.55.5毫秒。电击变换与温度相关联并且通常在0到4处发生。 由于转化载体多含有LacZ基因，因此常用含有不同抗生素的选择性培养基结合互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。 利用噬菌体粒子可以有效地将DNA注入宿主细胞的特点，科学家也发

15、明了重组DNA分子的体外包装法。 包装的基因工程噬菌体粒子可以通过细菌表面的噬菌体受体部位向受体细菌注入DNA，在这些细胞中得到繁殖和表达。 5. 2. 3聚合酶链反应(PCR )技术聚合酶链反应是快速扩展DNA序列的最常用方法。 如果PCR反应的模板DNA是基因组上的某个片段，则称为genomic PCR，如果是基于mRNA逆转录的cDNA，则称为RT-PCR。图5-7聚合酶链反应(PCR )技术，图5-8 PCR指数扩增时的循环次数和DNA产物数的比较，1989年12月，萩名的自然科学杂志SCIENCE将PCR和其使用的聚合酶命名为最初的“年度分子”的主编Daniel koshlash 从

16、那以后，PCR发展为越来越强大、具有广泛用途的技术。 有了PCR，极少量的遗传物质也可以在很多普通实验室得到，可以增加可用于生化分析和鉴定的材料。 “SCIENCE”的确是1985年首次发表关于PCR的论文。 但是，穆里斯写的记述PCR技术的论文被拒绝了。 编辑部对他说：“这篇文章通过了审查委员会的初选，可惜专家们没有预定同时采用本论文的审查结论的原稿那么积极。 因此，尊稿不能与本刊有限的篇幅竞争。 凯莉穆里斯(Kary Mullis )，1944年出生，1962年从佐治亚工科大学化学工程专业毕业，受到学生们的吸引，1966年录用了加利福尼亚州伯克利大学生物化学专业的研究生。 1968年一个人在NATURE发表了时间反转的宇宙学意义论文，通过了博士课程学生资格考试。 1972年获“微生物铁转运因子结构与有机合成”博士学位。 毕业后，虽然想写小说，但失败了“不能让一部分人物有不幸的遭遇”，讨厌每天屠宰实验鼠，失去了两次工作。 他有着