疟原虫的镜检技术-制片染色.ppt

1、疟原虫镜检查技术的制作和染色，发表内容，薄血膜的制作和染色。 疟原虫的订正数方法。血膜制作(必要设备)、载玻片：新玻璃板浸泡在装有液体洗涤剂的清水中10-20分钟，用干净的棉毛巾一个一个擦拭，用干净的水洗，晾干，最后用干净柔软的棉毛巾擦拭玻璃板。 将使用过的玻璃板在洗涤剂溶液中浸渍12天，或者在煮沸的5%肥皂水中浸渍12小时，在新配置的洗涤剂溶液中放入12小时，逐个擦拭血膜的痕迹，用清水清洗，擦拭。 采血针：一次性玻璃盒：防污染和昆虫吸血防止膜75%酒精棉球：采血前后消毒标记：在玻璃板上写上号码，制作血膜(采血时间)，与现症患者在流调查时不必考虑采血时机。 但是，将某一时期的疟原虫作为标本诊断

2、时，必须把握适当的采血时期。 疟疾的典型临床表现分为前驱期、发冷(寒战)期、发热期、发汗期和间歇期5期。 中日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫的发育，由于原虫密度过低，镜检多为阴性。 发冷(寒战)期相当于红内期成熟裂殖体膨胀红细胞的期，镜检以裂殖体和环状体居多。 在发热期，外周血中以环状体(小滋养体)为主，也可见裂殖体。 发汗期原虫密度过低，镜检多为阴性。 发作后数小时，间歇期外周血中以大滋养体为主，形态易辩解，是诊断的有利时机。 发作36-48h，可检出裂殖体发作12次后，出现了很多配偶体。 恶性疟理想的采血时间为发作后20h以内采血，发作后2小时左右，此时环状体发育至最高峰，初发患者退热后，未

3、常找到原虫。 从外周血中检出恶性疟原虫配子体是在外周血中出现环状体710天后。 血膜的制作(采血操作)，采集标本，在制作血片之前，首先要确认患者的姓名、年龄、住所。 采血部位和方法，耳垂或无名指(婴幼儿的拇指或脚后跟)，通常用耳垂采血，先用75%酒精棉球消毒采血部位，酒精干燥后，用左手大拇指与食指紧紧握在耳垂上或无名指的指尖，右手不应拿消毒针迅速刺入皮肤然后用左手拇指、食指、右手中指配合轻轻按压出血滴。 用于检查疟原虫的血涂片有两种。 一种是把血液涂成薄膜状，叫做薄血膜。一种是把血液涂成圆盘状，叫做厚血膜。 最好在一块玻璃板上同时制作厚、薄两种血膜。 以涂抹厚、薄血膜的位置为标本的血片，每片玻

4、璃板厚、薄血膜各1片。 方法是将幻灯片6等分，为在第1、2段贴上标签和编号而准备的厚血膜涂抹在第3段的中央，薄血膜涂抹在从第4段的前缘开始第6段的中央。 门诊和发热患者的血片每片1人，涂上2层厚的血膜，涂上1层薄的血膜，以免血膜脱落接受影响检查。标本片、发热患者的血液片、标签、厚厚的血液膜制作，取一片清洁的载玻片，左手平放载玻片，右手拿压片，在压片的一角从采血部位刮取约45微升的血液量(相当于火柴头)，使血液滴接触平坦的载玻片外观、圆形厚度均匀，边缘整齐。 太厚容易脱落，太薄不能达到检出率的要求，1个油镜视野5-10个白细胞较好。 薄血膜的制作是在按压片的一端缘的中点从采血部位刮取约11.5微

5、升的血液量(相当于1/4匹配头尺寸)，使血滴接触平坦的载玻片的中线，形成25350的夹角，当血液向两侧扩散约2cm2.5cm时，均匀且迅速地注意：按压时的速度必须均匀，血滴的大小、按压片与载玻片之间的夹角大小以及展开血膜的速度等常常影响血膜的厚度。 也可将载玻片平放在桌上进行操作。位于玻璃板左半部或从第4段的前缘开始第6段的中央的位置和外观、舌状的厚度均匀，在没有损伤的玻璃板上形成平坦的红血球，红血球之间必须相互不重叠地接触。 准确的按压姿势，标准的疟疾薄血膜的位置，血膜的编号，血膜做好后，立即在玻璃面上贴上标签，写上被检查者的编号，防止错误的薄血膜干燥后，用铅笔在薄血膜上写上血片的种类编号和

6、被检查者的个人编号，依次插入样品箱制作血膜注意事项，清洗玻璃板，为了不碰撞、磨损玻璃板，必须完全清洗没有油污和污垢。 制作电影时，要避免手指接触玻璃板表面，避免油污使薄血膜脱落空白部分和厚血膜。 为了使挤出的血膜均匀一致，挤出片玻璃板的边缘必须光滑。 刚涂好的血膜躺在样品盒内，在厚血膜不干之前不要倾斜样品盒，使血膜向一侧倾斜，血膜厚度不均匀，在厚处溶血和着色不易，影响检查结果。 晾干血膜时要注意防尘，防止苍蝇和蟑螂等昆虫吸血膜。 晾干后，请立即放入标本箱，盖好。 血液膜自然干燥，不能在毒太阳下晒黑或用火烤。 为了加快干燥，可以用手背和衣服摩擦，用风吹，干燥后用甲醇固定薄的血液膜。 夏天的标本尽

7、量在24-48h内固定染色的冬天也不能超过72h。 放置时间越长，厚的血膜越难溶血，染色效果也越差。 如果不能及时染色，较薄的血膜先用甲醇固定(13分钟)，再用过滤清水将较厚的血膜溶血，晾干后装入箱内复盖，待染色为宜。 染液的种类、疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏(Wright stain )和姬氏染液(Giemsa stain )。 因为这些染液的主要染料中含有美蓝、伊红、由美蓝氧化而成的天蓝，所以被称为多色性染料。 我们主要采用姬染液，具有方便、染色效果稳定、容易长期保存的优点。 瑞氏染色染色时间短，但染色效果不如姬氏稳定，主要用于门诊诊察量多的门诊实验室。 染液的染色原理是染料

8、和被染物的阴阳离子相互吸附结合的化学反应。 红、白细胞、疟原虫所含蛋白质氨基酸电离的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所具有的阴阳离子相互结合染上不同的颜色。 疟原虫和白血球的细胞浆染成蓝色，红血球、疟疾原虫和白细胞核染成紫红色。 红白细胞疟原虫的蛋白质全部由氨基酸组成，各氨基酸电离带正电荷的NH3和带负电荷的coo。 多色染发剂的碱性染料美蓝的有色基带有阳离子，可以和细胞中带有负电荷的-COO-部分结合成蓝色。 疟疾原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白血球的颗粒等酸性蛋白质染成蓝色。 酸性染料的伊红有色基团带有阴离子，可与细胞中带正电荷的NH2部分结合呈红色，但美蓝和伊红虽然不能着色疟原

9、虫和白细胞核，但由于美蓝氧化产生的天蓝有媒染作用，在媒染物和染料的共同作用下，疟原虫和白细胞核呈紫色注意：蛋白质和氨基酸是两性电解质，染液的pH要求为7.0-7.2。 染液变成偏酸时，带有的正电荷增加，容易与伊红结合，将红血球和疟原虫的核染成鲜红色，淋巴细胞和原虫的细胞浆着色不良，相反，染液偏向碱时，红血球和嗜伊红白血球的粒子等染成浅蓝色，难以观察。姬氏染液母液的配置方法、材料： 1、姬氏粉5g2、甘油250ml 3、甲醇250ml将姬氏粉放入乳钵中，加入少量的甘油充分研磨，同时放入500ml的带塞玻璃瓶中直到甘油加入。 在擂钵中放入少量甲醇，将剩下的部分洗掉，放入瓶中，再次放入甲醇洗净后，放

10、入瓶中直到洗净钵。拧紧塞子，充分摇动，放入5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，每天用力摇动5分钟即可制成原液。 调制12周后可以使用。 姬氏染液现在是优秀的血膜染剂，能够长期保存而不变质。 注意事项：1.高纯度试剂。 2 .使用的器皿绝对没有水(伊红在水溶液内遇到美蓝或天蓝时会相互结合沉淀，丧失染色力)。 3 .边加边磨，请充分磨。染色液整体的配制时间不能超过5小时。 姬氏染液的染色方法是：血片干燥后，用甲醇或无水醇固定薄的血膜(瑞氏没有固定的必要)，用清水将血红蛋白溶解在厚的血膜中(也可以直接染色)，然后染色。 注意：吸取母液时，不要摇瓶，以免沉淀物影响染色效果。 批量血片染色：将用

11、甲醇固定的薄血膜的血片插入染色筒中，加入3%姬氏染液稀释液(在3毫升的姬氏原液中加入缓冲液或蒸馏水97毫升，搅拌)浸渍在血片中，同时将薄血膜染色3040分钟(根据当地情况适当增加染色时间) 用清水轻轻的单片血片染色：在处理过的血膜中加入2-3滴姬氏母液，加入1ml缓冲液或蒸馏水，均匀混合，染色15-20分钟，然后用清水轻轻清洗片上的染液，并晾干镜检。 (不直接打倒玻璃板染液，使残渣不附着在玻璃板上，不影响镜检)理想的染色结果是红细胞淡红或淡紫红色，疟原虫的细胞质为蓝色，核为紫红色，疟色素为褐色。 快速染色调制8-10%染液(每片血液约2ml):量筒内量为2ml的缓冲液或新鲜冷水，直接滴入姬氏原

12、液4-5滴，混合，滴入染色标本的薄血膜，染色10-15min，清水细微缓冲的缓冲调制3%染液： 清水仔细缓冲洗净，晒干镜检。 姬氏染液浓度、外来染色、血片制作染色评价标准、影响染色效果的因素、血片染色的好坏与玻璃片的清洁度、血片制作质量和染色技术等有关，(1)染剂、溶剂的质量染料、甲醇和甘油要用分析纯，(2)染液的新旧染液的保管时间长新制备的染液因色素不充分溶解，染色力弱，多呈偏碱性。 通常在染液调制12周后使用，但是装有染液的瓶子要密封，以免吸收湿气影响染液的品质。 (3)染液稀释后的使用时间现在必须使用稀释染液，当时被使用，一般为0.5h，染色力最强。 姬氏和瑞氏染液的主要成分是美蓝，伊红

13、和由美蓝氧化生成的天蓝，三者溶解在甲醇中，而伊红在水溶液中遇到美蓝和天蓝就会沉淀。 影响染色效果的因素有： (4)染液的稀释浓度染液的浓度高、着色快而深，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗而显着，但颜色总是偏于碱的染液浓度过低则染色时间变长，颜色变酸，雪氏点不清或消失。 (5)染色时间染色时间必须根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温适当增减。 染色时间长，染色效果好，反而差。 室温高着色快，染色时间稍短，气温低适度变长。 (6)染色用水染液的稀释用水和染色后清洗用水选择pH7.0-7.2缓冲液(Na2HPO4、KH2PO4)，也可以使用新鲜的蒸馏水或过滤后的冷水。 现场没有上述条件的情况下，井水、河水

14、、泉水、雨水也可以利用。 (7)清洗方法为：沿玻璃板或染色筒的边缘加水使染液表面进一步溢出，轻轻清洗，以免染液色素粒子附着在血膜上。血片染色的注意事项、母液配置时的过滤可以去除杂质粒子，有助于镜检质量的提高。固定薄血膜时，不要让甲醇接触厚血膜。 洗净染液时，水流轻，不要流过厚厚的血膜。 原虫密度约简、估计疟原虫感染程度有三种方法：采用半定量约简法、厚膜白细胞密度约简法、厚膜红细胞感染率约简法、薄膜白细胞疟原虫密度约简法(WHO推荐)用于临床诊断，评价抗疟疾后的疟疾，在厚膜的每个视野下分别估算观察疟原虫密度。 该方法简便，缺点是订正的疟原虫数量受血膜厚度薄的影响，只能定性，不适于定量分析。 在国

15、内常用。 该方法将密度分为6个阶段：全厚血膜上发现疟原虫的数量在10个以内，记录实际数字的全厚血膜上发现疟原虫的数量在10个以上，但每视野不足1只，“少”平均每视野记录15只虫，“平均每视野记录610只虫” 记录“平均每视野11100只”的“”，半定量修正数法可以用厚血液膜，根据需要选择视野，修正200个白细胞的同时，修正同时观察的疟原虫的数量，原虫密度低的话可以增加白细胞修正数(500 1 000个)。 白血球疟疾原虫的订正公式：疟疾原虫数订正数的白血球数患者每微升的白血球数=疟疾原虫数/l血。 如果不知道患者的白细胞数，每1微升用8000个白细胞进行订正(国际标准)，国内用6000个白细胞进行订正。 白细胞疟原虫密度校正法、白细胞疟原虫校正法的例子是，在校正200 WBC的同时，校正40个疟原虫，在不知道患者白细胞数的情况下，每1微升8，000个白细胞数，每1微升血液疟原虫密度为：40 (原虫数) 适用于疟原虫密度高的情况。 有时在1个视野中反复计数。 首先，将视野分为4个象限，从右上象限按时间校正对视野整体进行计数。 计数方法、计数方法、计数方法、计数方法、计数方法、计数方法、计数方法。 在镜检时，请记录观察到的各种疟