博士后研究报告(出站)

PAGEPAGE18分类号 级 UDC 号 南方医科大学结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、HLA-DRB1*0405限制型T细胞表位FunctionalandStructuralCharacterizationofanHLA-DRB1*0405-restrictedTcellEpitopefromTypeIICollagenRelevanttoRheumatoidArthritis张娜茹工作完成日期 2017年7月至2019年12月报告提交日期 2020年1月南方医科大学（广东）2020年1月结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、HLA-DRB1*0405限制型T细胞表位FunctionalandStructuralCharacterizationofanHLA-DRB1*0405-restrictedTcellEpitopefromTypeIICollagenRelevanttoRheumatoidArthritis博士后姓名：张云开流动站（一级学科）名称：药理学专业（二级学科）名称：抗炎免疫药理学研究工作起始时间 2017年7月1日研究工作期满时间 2019年12月31日南方医科大学人事部（广东）2020年1月内容摘要类风湿关节炎（RA）TII类分（MHC30-40%HLA-DRB1*0405（CII）T细胞表位及它是如何与HLA-DRB1*0405分子结合进而相互作用的尚未被科研工作者报道。通过多肽竞争结合实验，我们发现了一条来源于CII的多肽hCII931-949与HLA-DRB1*0405分子具有很高的结合力,HLA-DRB1*0401分ThCII259-273HLA-DRB1*0405E266LhCII259-273_E266LHLA-DRB1*0405分子的结合力大幅hCII931-949HLA-DRB1*0405分子的主要结合位点并得到了DRB1*0405-hCII931-949的晶体结构。CII特异性，HLA-DRB1*0405T细胞表位的鉴定为类风湿关节炎疫苗的研发和临床应用奠定了科学基础。HLA-DRB1*0405,二型胶原蛋白，T细胞表位，AbstractRheumatoidarthritisisaTcelldependentautoimmunediseasewithastrongassociationwiththemajorhistocompatibilitycomplexclassII(MHCII)gene.Upto30-40%oftheEastAsianRApatientspossessHLA-DRB1*0405allelwhichisassociatedwiththedisease.AjointproteinthathasbeensuggestedtoplayaroleintheonsetofarthritisistypeIIcollagen(CII)butitissofarunknownhowtherelevantpeptideisboundandrecognizedwhenpresentedbyHLA-DRB1*0405allele.WehavenowidentifiedhowhCII931-949peptidefromhumanCIIbindstotheHLA-DRB1*0405allelebycompetitivepeptidebindingassayandcrystalstructure.TheDRB1*0405moleculewasfoundtobindthehCII931-949peptidebutwithdramaticallyreducedaffinitytothewellidentifiedHLA-DRB1*0401TcellepitopehCII259-273.TheE266LaminoacidsubstitutionatP4pocketofthehCII259-273peptideincreasedthebindingaffinitywithHLA-DRB1*0405molecule.ThekeyresiduesthatareimportantforHLA-DRB1*0405bindingwereidentified.Furthermore,wegotthecrystalstructureofHLA-DRB1*0405complexedwithhCII931-949peptide.TheCII-specific,HLA-DRB1*0405restrictedTcellepitopeidentificationmightlayascientificfoundationfortheRAvaccinedevelopmentandclinicaluse.Keywords:Rheumatoidarthritis;MHCII;HLA-DRB1*0405;typeIIcollagen(CII);Tcellepitope目次引言 9类风湿关节炎的研究意义 9类风湿关节炎的国内外研究现状 11类风湿关节炎的遗传因素 11类风湿关节炎的自身抗原及其T细胞表位 12实验材料与方法 14实验材料 14实验试剂与耗材 14主要仪器 15实验方法 16E.coliDH5α化学感受态细胞的制备 16PCEP4-DRA1*0101及PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut表达质粒的构建与鉴定 16质粒共转染ExpiHEK293F细胞以表达DRB1*0405-hCLIPmutd蛋白 16DRB1*0405-hCLIPmut蛋白的纯化 17西方印迹法鉴定DRB1*0405-hCLIPmut蛋白 17多肽竞争结合实验 19HLA-DRB1*0405-hCII931-949复合物结晶及其晶体结构解析 20从RA病人全血中提取基因组DNA. 20从RA病人抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC). 21酶联免疫吸附实验(ELISA) 22统计处理和分析 22实验结果与分析 22表达质粒获得成功构建 22西方印迹法鉴定HLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白获得成功表达 24对影响蛋白表达量的转染条件进行饿优化 24多肽竞争结合实验证实HLA-DRB1*0405分子可特异性结合hCII931-949多肽 24P-2、P1、P4和P8是hCII931-949多肽与HLA-DRB1*0405分子结合的主要位点 27HLA-DRB1*0405分子与hCII931-949多肽复合物的晶体结构 28PBMC体外刺激实验 294.讨论 305.结论 346.致谢 357.参考文献 368.结尾 39图表清单图1 10图2 20图3(A-B) 23图4 24图5 24图6(A-C) 26图6(D) 27图7… 28图8 29图9 30英文缩略词对照表AlanineAntigenpresentingcell

AAPCCollagen-inducedarthritis CIACollagentypeIIEnzymelinkedimmunosorbentassayGlycineGlutamineHemagglutininHumanleukocyteantigenMajorhistocomplexclassOpticaldensityPheripheralbloodmononuclearcellPhenylalanineRheumatoidarthritisProlineSharedepitopeTcellreceptorTheronine

CIIELISAGQHAHLAMHCODPBMCFRAPSETCRT结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、HLA-DRB1*0405限制型T细胞表位引言类风湿关节炎的研究意义类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一种以慢性滑膜炎为主的自身15-25%的患者中也可能会影响到身体的其它器官，比如眼睛、皮肤、心脏、肾脏和神经系2016RA6000万。RA发病率及致残率都非常高，对人类健康造成非常严重的威胁，被称为“不死的癌症”。目前临床上采用的药物治疗主要包括非甾类抗炎药、慢作用抗风湿药（Disease-modifyinganti-rheumaticdrugs，DMARDs）、免疫抑制剂、生物制剂及植物药等，治疗的主要目的在于减轻关节炎症反应，抑制病变发展及不可逆骨质破坏，尽可能保护关节和肌肉的功能，最终达到缓解病情或降低疾病活RA患者使用上述药物几年后常常会出现明显的毒副RA是一种自身免疫性疾病，自身抗原的确定显得尤为重要。人体内存在多种关节特异性蛋白，例如：二型胶原蛋白（CollagentypeII,CII）、人体软骨糖蛋白（HCgp39）、瓜CIIRACII的抗体[1]（Collagen-inducedarthritis,CIIRACIIRACII可使小鼠产RA的症状RACD4+TT细胞CII中某个翻译后修饰肽段被抗原递呈细胞（APC）细胞膜表面表达的主要组织相容性复合物（MHC）IICD4+T细胞受体（TCR）T细（CIICII263-271已被发现MHCIIT（Tcellreceptor,间的结合也获得了成功鉴定[4]RACD4+TCII主要抗原决定区的确定显得至关重要。图1.抗原递呈细胞（APC）与CD4+T细胞之间的相互作用。APC递呈的MHCII分子与之结合的多肽复合物被CD4TCR识别，在共刺激分子的作用下将T细胞活化。HLA-DRB1（SharedepitopeRA最密[5]RA患者中HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0404基因型所占比重较大，而在亚洲RA患者中（在中国、日本、韩国人群尤为显著）约30-40%的患者携带HLA-DRB1*0405等位基因[6-8]。在CIA模型和HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0401或HLA-DRB1*0404等位基因携带者的RA病人中间，自身反应性T细胞能够识别同一条CII260-273肽段[3]。位于264位点的赖氨酸（K264）T细胞识别糖基化的CII多肽在关节炎产生方面起到了非常重要的作用[9]。Balik等人研究表明在CIA动物模型中，糖基化CII259-273/Aq复合物有效抑制了关节炎的产生[10]。该研究主要针对携带HLA-DRB1*0405主导基因型的亚洲RA患者，旨在确定CII特异性，HLA-DRB1*0405限制性T细胞表位，该表位的确定将为RA疫苗的研发奠定科学基础。类风湿关节炎的国内外研究现状类风湿关节炎的遗传因素RA是一种相对复杂的多因素导致的慢性自身免疫性疾病，环境因素比如RA621.31HLA复合体Stastny1978年首次证实HLA-DRB1*0401基因与RA[121986Nepom发现了HLA-DRB1*0404基因也与RA存在着一定关联性[13]RA相关的等位基因包括：HLA-DRB1*0101、*0102、*0401、*0404、*0405、*0408、*0409*0410*1001*1402*1406和*1409HLA-DR分子β链位于70-74位点的第三超变区共同拥有一个相似的表位：QRRAA-*0101、*0102、*0404、*0405、*0408、*0410、*1402、*1406；QKRAA-*0401RRRAA-*1001[5]。这一共享表位区大大影响了与多肽的CD4+THLA-DRB1*0402(DERAA)则被列为保护基因型[14]。相关研究证实该共享表位区在种族之间存在很大的差异：在欧洲RAHLA-DRB1*0101、*0401和*0404的比重较大[8]，然而RA30-40%HLA-DRB1*0405所占比重最大。相关文献报道，HLA-DRB1*0405基因尤其与韩国，日本和中RA11.9%HLA-DRB1*0405等位基因[15]HLA-DRB1*0405基因AIHLA-DRB*05限制型T细胞表位的鉴定是首要任务。类风湿关节炎的自身抗原及其T细胞表位RACIIHCgp39RARACII是构成关节透明软骨的主要蛋白，在3%-27%RA患者的血清中可检测到CII的特异性抗体[16]，而且在最常用到的CIA动物模型中用CIICII蛋白的翻译后修饰在诱发炎症过程中起到了至关重要的作用。RACD4T细胞[18]在Aq和DR4转基因小鼠模型中，位于CII264和270位点的两个赖氨酸可羟基化继而糖基化，这一修饰可被T细胞识别，从而诱发CIA或者对自身CII产生免疫耐受[19,20]。目前研究最多的HLA-DRB1*0401分子与RA相关的T细胞表位为CII261-273,IC50表示为180nM[21]和*0101转基因CIA动物模型中自身反应性T细胞能够识别CII蛋白259-273段表位[22]，这段表位与Aq相结合。T细胞可以特异性识别这段翻DR4的RA患者中[17]，这一发现表明RA患者带来光明。然而种族差异，不同的种族携带不同的HLA-DRB1分子，不同的HLA-DRB1分子结合的T细胞表位也会存在一些差据相关文献报可以结合HLA-DRB1*0405分子的多肽包括CII256-271：GEPGIAGFKGEQGPKG[23]CII429-442:GGVGPIGPPGERGA、CII593-610:SGFQGLPGPPGPPGEGGKP 、和CII 1064-1081:RGFTGLQGP24]I11这条多肽能够刺激67%的携带HLA-DRB1*0405RA患者的PBMC产生IL-2和IFN-γ[25],CII1064-1081是HLA-DRB1*0405TCII的三螺旋结构重新命名多肽一系列多肽竞争结合实验和晶体结构首次从结构和功能上鉴定了CII来源的HLA-DRB1*0405分子限制型的T细胞表位。实验材料与方法实验材料实验试剂与耗材hCII931-949 (GHRGFTGLQGLPGPPGPSG); hCII931-945(GHRGFTGLQGLPGPP)及其被丙氨酸逐一位点替换的多肽;hCII259-273(GIAGFKGEQGPKGEP);hCII259-273_P4E266L(GIAGFKGLQGPKGEP);HA306-318(PKYVKQNTLKLAT)以及生物素标记的hCLIPBiotin-Ahx-hCLIP:Biotin-Ahx-KPVSKMRMATPLLMQA)Biomatilk的纯度都在95%以上。HLA-DRA*0101,HLA-DRB1*0405-hCLIPmut和HLA-DRB1*0405-hCII931-949EurofinsGenomics,QIAampDNAbloodMidiKitQIAGEN10,000XGelrednucleicacidgelstainBiotium公司。Expi293FTM细胞,Expi293蛋1640humanIL-2-4-12Bis-Tris蛋白分离胶和IFNgammahumanuncoatedELISAkit均购自Thermofisherscientific公司。FectoPROTMPolyplus16/60Superdex200pg凝胶过滤预装柱,2030kDa蛋白浓缩管,AmershamhyperfilmECL化学发光试剂盒和Ficoll-paqueTMplus均购自GEHealthcare公司。辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的山羊抗SouthernBiotechDELFIAEu-N1Streptavidin购自PerkinElmer公司。5ml,10ml25mlSarstedt公司。HPLC级纯水购自山海默ELISACostar3590酶标板购自VWR公司。主要仪器冰箱 DZHaier冰箱 Ranshen-80℃超低温冰箱88000ThermoFisherScientific磁力搅拌器 GL-3250CKylin-BellLabInsruments抗体孵育摇床 TSC-8QilivBEIERYIQIZHI水平摇床TS-1 QilivBEIERYIQIZHI电泳仪 BG-Power6000 蛋白电泳槽 Mini-proteanBio-RADDNA电泳槽Mini-SubcellGT 台式离心机 5810REppendorf落地式高速离心机 J-E BECKMAN金属浴锅BYQ6044E-216 BIOERTECHNOLOGYCOCTD加热恒温水浴锅HWS12/HWS28 上海一恒科技公涡旋振荡器 MixerV6ESSENSCIEN手掌离心机 XK-400 珠海黑马医学仪器有限公司超高灵敏度化学发光成像系统ChemiDoctouch美国BiotekG1000基因扩增仪 TC-96/G/H（b)B杭州博日科技PH测量仪 S210 梅特勒-拖利多仪器（上海）有限公分析天平220g ME203E METTLERTOLEDO37℃CO2培养箱 HF90/HF240ThermoFisherScientific恒温摇箱ZHCHENE制冰机 XB-130-FZ/R134A GRANT烤箱 HH-811-500 上海市跃进医疗器械厂倒置显微镜 CKX31 OlympusSynergyH1BiotekGEhealthcare实验方法E.coliDH5α化学感受态细胞的制备取一管商品化的E.coliDH5α,在制备好的LB固体培养平板375mlLB液体372mlLB37OD600=0.4500ml3000g,41520ml0.1MCaCl2303000g,4104ml15%0.1MCaCl2-80℃低温保存。PCEP4-DRA1*0101及PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut质粒的构建及鉴定HLA-DRA1*0101HLA-DRB1*0405-hCLIPmut基因序列送公司合成后，PCEP4DH5α化学感受态细胞中，371LB平板中挑取单克隆，37℃培养过夜后抽提质粒，然后通过双酶切和测序的方法共同鉴定质粒序列的准确性。ExpiHEK293FDRB1*0405-hCLIPmut蛋白ExpiHEK293F1x106/ml37℃二氧化碳细胞培养箱悬浮培养。24Opti-MEM培养液的试FectoPROOpti-MEM培养液的试管中按一定比例加入PCEP4-DRA1*0101PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut质15分钟后，把混合物逐滴加入ExpiHEK293F37℃二氧化碳细胞培养箱继续培养。DRB1*0405-hCLIPmut蛋白的纯化5-680%左右终止细胞培养，离心细胞培养0.45μm蛋白经纯化系统（镍离子亲和层析和尺寸排阻色谱法）纯化。首先用含有50mMTris-HCl,150mMNaCl,10mMImidazoleHis-TrapExcel柱子，50mMTris-HCl,150mMNaCl,500mMImidazole的洗脱液洗脱蛋白，洗脱下来的蛋白经过10KDAmiconUltracentrifugalfilterunitsHiLoadSuperdex200pg纯化柱去除蛋白聚集体。纯化后的蛋白可Mouseanti-DR和二抗anti-mouse-HRP经下述西方印迹法鉴定。DRB1*0405-hCLIPmut蛋白常用缓冲液及其配制①30％丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 29g甲叉丙烯酰胺 1g蒸馏水 100ml搅拌器搅拌溶解，待完全溶解后，过滤，4℃避光储存备用。②2×上样缓冲液(pH6.8)62.5mMTris-HClpH6.8，2%w/vSDS，10%甘油，50mMβ-巯基乙醇，0.01w/v1MTris-HCl(pH6.80.6250.21ml，β-巯基乙醇0.5ml，溴酚兰0.001g，用水补加至5ml。③Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mMmMw/vSDS10×mlddH2O30.2g188g100mlw/v10SDS，用ddH2O1000ml。④电转移缓冲液25mmol/Lmmol/Lw/v甲醇(pH8.5)。10×储液，900mlddH2O58g碱，29g3.7gSDS，ddH2O800ml80mL10×ddH2O800ml，加入200ml甲醇，4℃预冷备用。⑤10×Tris-盐缓冲液(TBS)24.2g碱，80gNaCl800mlHClpH7.6，加ddH2O1000ml1×TBS0.1%TBST洗涤液。⑥封闭液1×TBS0.1%5%w/v脱脂奶粉，搅拌溶解。⑦抗体稀释液1×TBS0.1%5%w/v脱脂奶粉，搅拌溶解。免疫印迹操作步骤4-12%凝胶1.5-2(恒流，16mA/gel)，保证所加样品蛋白总量一致。SDS-Bio-Rad()。③转膜结束后，将硝酸纤维素膜置于平缓摇动的摇床上，以20ml封闭缓冲液室温下封闭1小时或4℃封闭过夜。④5mlTBST洗膜5次，每次3分钟。⑤一抗Mouseanti-DRL243单克隆抗体用抗体稀释液2000倍稀释，在摇床上室温孵育1小时，确保抗体稀释液能完全覆盖膜。⑥用25mlTBST洗膜5次，每次3分钟。⑦HRP标记的羊抗小鼠二抗用抗体稀释液30000倍稀释，在摇床上室温孵育1小时，确保抗体稀释液能完全覆盖膜。25mlTBST53分钟。⑨膜稍沥干后加入化学发光试剂(125μl/cm230A、B液混合)室1X胶片贴在一起进行曝10X多肽竞争结合实验PBS2倍稀释，50μl/non-binding96孔板，然后在上述缓冲液中加入适量的DRB1*0405-hCLIPmut蛋白和Biotin-Ahx-hCLIP0.1μM3μM,50μl/9648L243ELISA板，PBST96ISA31T2000倍稀释的Eu-Streptavidin,371小时洗板，最后加入Enhancement溶液，5分钟后读板。图2.多肽竞争结合实验图解HLA-DRB1*0405-hCIIPep.复合物结晶及晶体结构解析利用坐滴蒸汽扩散法获得HLA-DRB1*0405-hCII931-949蛋白复合物晶体，拿到晶体之后进行X射线衍射，收集衍射图谱，通过计算，进一步得到该蛋白复合物的原子结构。RADNAA4.4mlddH2OQIAGEN-20B15ml100μlQIAGEN蛋白酶,1ml全血，轻轻混匀。C1.2mlAL151分钟以充分混匀，然后置于70℃水浴10分钟。D1ml96-100%10次，然后涡旋震荡以充分混匀。E、将所有混合液轻轻转移到试剂盒提供的QIAampMidi柱式离心管，3000rpm离心3分钟。F、弃掉过滤液，加入2mlAW1缓冲液，5000rpm离心1分钟。G、加入2mlAW2缓冲液，5000rpm离心15分钟。HQIAampMidi15ml200μlddH2O,室5分钟，5000rpm2分钟。IDNA2μlNanodrop测浓度，取适量送北京旌准医疗科技有限公司做HLA-DRB1DNA样品置于-20℃冰箱冻存。RA病人全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）A10mlHLA-DRB1*0405RA病人静脉血。B、取8ml血液到50ml离心管，以等量PBS稀释。C、另取50ml离心管，在管底轻轻注入20mlFicoll,将稀释好的血液轻轻铺在Ficoll上。D、离心机升速和降速设置为0，20℃，400g离心30分钟。E、用移液枪轻轻吸出PBMC层到一个新的50ml离心管中，加入30mlPBS,400g离心10分钟。F、弃上清，2mlRPMIPBMC,1x106个细胞/9620μg/mlIL-2细胞因子，将96孔细胞培养板置于37℃二氧化碳细胞培养箱培养7天。酶联免疫吸附试验（ELISA）A、待PBMC培养到第6天，用抗人IFN-gamma的抗体铺酶标板，100μl/孔，4℃过夜。B、第二天，PBST洗板五次，室温封闭1h。CPBST7μl/过夜。D、清洗五次，加入生物素标记的抗人IFN-gamma抗体，100μl/孔，室温孵育1小时。E、清洗五次，加入100μl/孔Avdin-HRP,室温孵育30分钟。F、清洗五次，加入100μl/孔1XTMB溶液，室温孵育15分钟。G、待标准品孔出现明显阶梯状蓝色之后加入50μl终止液。K、10分钟之内450nm检测OD值。L、绘制标准曲线，计算浓度。统计学处理和分析GraphpadPrism5±标准差(x±SD)unpairedt-test方法；双方法。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表明组间的差异有统计学意义。实验结果与分析表达质粒获得成功构建如图3A,His-tag为纯化蛋白用，Fos/Jun序列的加入能够保证α和β链形成hCLPmut的存在有助于维持α1和β1Pocket的空间构象。Thrombin酶切位点的加入3BHLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白的空间结构示意图。(A)(B)图3.(A)α和β链表达序列示意图。(B)HLA-DRB1*0405-hCLIPmut及其嵌合的多肽组成的蛋白复合物的空间结构示意图。HLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白获得成功表达4.蛋白；2：HLA-DRB1*0401-hCLIPmut蛋白(阳性对照)；3：BSA(阴性对照)。一抗MouseAnti-DRL243Anti-mouseIgG-HRP，30000倍稀释。对影响蛋白表达量的转染条件进行了优化HLA-DRB1*0405-hCLIPmutαβ5和β3:28.4mg/L。5.α和β1：1；2：HLA-DRB1*0405-hCLIPmut0.01。多肽竞争结合实验证实HLA-DRB1*0405蛋白分子可特异性结合hCII931-949多肽（Hemagglutinin）的HA306-318多肽作为阳性对照，因为该多肽已经被证实为与HLA-DRB1*04分子结合力很强的主要抗原表位。如图6AHLA-DRB1*0405和HLA-DRB1*0401HA308-316之间具有相似的结合力，hCII259-273多肽与HLA-DRB1*0401分子具有很强的结合力（IC50=26μM6B显示hCII931-949与HLA-DRB1*0401分子之间的结合力非常弱（IC50=5223μM）,HLA-DRB1*0405分子却具有很强的结合力（IC50=32μM。该实验证实hCII931-949可特异性结合HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽序列的比对显示P1P6P9P4hCII259-273多肽中P4（Glutamic被亮氨酸(Leucine，L)置换后用多（hCII259-273_P4E266LHLA-DRB1*0401（IC50=187hCII259-273HLA-DRB1*0401之间的结（IC50=26hCII259-273_P4E266LHLA-DRB1*0405hCII259-273_P4E266LHLA-DRB1*0405分子间的结合力（IC50=9μM）大幅度增强。(A)(B)(D)图6. 多肽竞争结合实验及多肽序列比对。(A)HLA-DRB1*0401与5分子与II-73HA306-38(A)HLA-DRB1*0401与HLA-DRB1*0405分子与hCII931-949多肽的结合，HA306-318用来做阳性对照(C)hCII259-273与hCII931-949多肽的序列比对。HLA-DRB1*0401 和 HLA-DRB1*0405 分 子 与 hCII259-273 和hCII259-273_P4E266L多肽的结合。P-2P1P4P8hCII931-949HLA-DRB1*0405分子结合的主要位点hCII931-949HLA-DRB1*0405分子结合的主要位点，我（Alanine替换的多肽类似物用来做多肽竞7P-2P1苯丙氨酸（Phenylalanine，F）P4亮氨酸（Leucine，L）P9甘氨酸（Glycine，G）位点的替换显著降低了与HLA-DRB1*0405分子的结合，相反的，脯氨酸（Proline,P）P8hCII931-949HLA-DRB1*0405P-2、P1P4P8P9hCII931-949HLA-DRB1*0405分子结合的主要位点。7.由丙氨酸替换的多肽类似物与HLA-DRB1*0405氨酸在P-2、P1、P4P9位点的替换显著降低了hCII931-949多肽与HLA-DRB1*0405P8hCII931-949多肽HLA-DRB1*0405分子的结合；其它位点的替换未引起结合力的改变。数据SD，,p<0.05;,p<0.01；,p<0.001。HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽复合物的晶体结构8hCII931-949多肽复合物的晶体结构hCII931-949P1、P4、P6P9的锚定位点：P1935位点（eFP48P6和P9是分940943的甘氨酸（,GR的角度看，II-9多936P2-939位点的P5-谷氨酰胺（Glutamine，Q）942位点的脯氨酸（Proline,P）都朝向口袋凹槽TCR结合的极性不带电的界面。8.HLA-DRB1*0405hCII931-949P1、P4、P6P9HLA-DRB1*0405分P2P5P8TCR作用的界面。PBMC体外刺激实验27A1ml/，2.2.8所述，从1ml全血中提取基因组DNA后送公司测序以筛选HLA-DRB1*0405RA9RA患者携带HLA-DRB1*0405等位基因，其中有四位阳性患者和一位阴性患者愿意无偿为10mlPBMC，通过多肽体外HLA-DRB1*0405等位基因的三位患者RA1、RA2RA3HA306-318多肽刺激产生IFN-gammaHLA-DRB1*0405等位基RARA4和健康对照（Healthycontrol，HC）对所加多肽没有任何RA1RA3hCII931-949hCII931-945_P8HyPPBMChCII931-945_P8HyP多肽刺激产生IFN-gamma。9.PBMCPBMC1x106个细胞/9620μg/mlIL-296377天，IFN-gammaSD，,p<0.05;,p<0.01。讨论RA是一种慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关导致关节畸形及功能丧失。RA是一种多因素诱发的疾病，虽然不属于遗传性疾病，但其发病可能与遗传因素有关。RA的发病有轻微的家族聚集倾向和孪RA的发病中起一定的作用。但是同卵100%30％～50％，而异卵双生子则更低，5RA像高血压、糖尿病一样不是由单一基因所决定的。RAHLA-DR4RARA30%HLA-DRB1*0405等位基因，该基因已被证RAHLA-DRB1*0405基因携带者的A(HLA-DRB1*0405-)T细胞表位，该研究从结构和功能上确定了一个CII来源的、HLA-DRB1*0405限T细胞表位。HEK293F细胞表达系统通过α/β链共转染的方法成HLA-DRB1*0405ELISA,Westernblotting方法α/βHLA-DRB1*0401HLA-DRB1*0405二者在蛋白水平仅存在两个氨基酸的差异：在第57位点，HLA-DRB1*0401分子是一个带有负电的天冬氨酸（cd，DHLA-DRB1*005分子是一个不带电的极性丝氨酸eS71位点，1分子是赖氨酸（sne，K，5分子是精氨酸（e，R，两者都带正电荷。已有研-1分子的TIHLA-DRB1*0405分子。于是，我们通过软件预测及文献报道初步确定了一条HLA-DRB1*0405T细胞表位，将其命名为hCII931-949。通过多肽竞争结合实验，发现这条多肽可与HLA-DRB1*0405HLA-DRB1*0401分子间的结合力却非常弱。我们进而对两条多肽的序列进行比对，发现P1、P6和P9P4hCII259-273的P4位点EI9的P4（-L，HLA-DRB1*0405HLA-DRB1*0401分子间的结合力大幅度降低，说明P4HLA-DRB1与多肽间的相互作用起到至关重要的作用。HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽间的具体结合位点，我们得到了该复合物的晶体结构。从晶体结构图可以看出，hCII931-949P1（Phe935）、P4(Leu938)、P6(Gly940)、P7(Leu941)和P9(Gly943)12HLA-DRB1*0405P2(Thr936)P3Gly937)P5Gln939)P8(Pro942)TCRTCR作用的残HLA-DRB1*0401T细胞表位hCII259-273264位点的赖氨酸可被翻译后修饰羟基化继而被单TCRhCII931-949942可能hCII931-945_P8HyP。通过携HLA-DRB1*0405RAPBMCT能就是THLA-DRB1*0405RAT细胞没有被激活，很可能跟患者的病情严重程度有关。该研究首次从结构和功能上鉴定了HLA-DRB1*0405限制型、CII特异性T细胞表位，在接下来的研究工作中，本项研究依然有几个问题需要解决：1）（）PBMC中的T细胞，体外经多肽刺激后通过流式明确T我们会继续针对这些问题进行研究和探讨，通过HLA-DRB1*0405人源化转基因小鼠模型，对筛选的T细胞表位对RA的致病性进行深入研究，以望对将来疫苗的研发提供新的理论基础。结论本研究从结构和功能上鉴定了在亚洲RA患者中与RA密切相关的HLA-DRB1*0405分子的T细胞表位。主要工作如下：首次在真核表达系统中表达了具有结构和功能的HLA-DRB1*0405分子。HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽之间的结合。HLA-DRB1*0405hCII931-949RAPBMC体外刺激实验确定了T细胞表位。RA个性化疫苗的研发奠定了科学基础。致谢201004博士后科学基金项目（201659512，南方医科大学基础研究前期启动项目（QD2017N005）的经费支持。首先，非常感谢瑞典卡罗林斯卡医学院医学炎症研究中心许秉泽博士在蛋白表达和纯化方面的指导；感谢葛长荣博士在蛋白结晶方面的工作。感谢药学院抗炎免疫药理学教研室李晓娟教授和NandakumarKuttySelva教授的关心和帮助。感谢原创性抗炎药物研发团队周春老师，博士研究生童冬梅，硕士研究生林晓吟、覃桂城、梁培彬等对研究工作的协助；感谢李露和曾嘉琪在行政方面的工作。感谢珠江医院风湿科于清宏主任和梁碧波医生，检验科周韶松医生和黄永红护士在临床样品收集工作上的鼎力协助。感谢曾经一起入站的博士后张月、王雪儿和张海鹰博士在学术上的探讨及分享。RikardHolmdahl教授对士后工作和生活的关怀及照顾。参考文献RowleyMJ,WilliamsonDJ,MackayIR.Evidenceforlocalsynthesisofantibodiestodenaturedcollageninthesynoviuminrheumatoidarthritis.ArthritisRheum1987;30:1420-5.LindhI,SnirO,LonnblomE,UysalH,AnderssonI,NandakumarKS,etal.TypeIIcollagenantibodyresponseisenrichedinthesynovialfluidofrheumatoidjointsanddirectedtothesamemajorepitopesasincollageninducedarthritisinprimatesandmice.ArthritisResTher2014;16.MichaelssonE,AnderssonM,EngstromA,HolmdahlR.Identificationofanimmunodominanttype-IIcollagenpeptiderecognizedbyTcellsinH-2qmice:selftoleranceatthelevelofdeterminantselection.Europeanjournalofimmunology1992;22:1819-25.KjellenBrunsbergU,BroddefalkJ,HansenB,M,IvarssonI,etal.ThestructuralbasisofMHCcontrolofcollagen-inducedarthritis;bindingoftheimmunodominanttypeIIcollagen256-270glycopeptidetoH-2AqandH-2Apmolecules.Europeanjournalofimmunology1998;28:755-67.GregersenPK,SilverJ,WinchesterRJ.Thesharedepitopehypothesis.Anapproachtounderstandingthemoleculargeneticsofsusceptibilitytoarthritis.Arthritisandrheumatism1987;30:1205-13.LeeHS,LeeSongGG,KimHA,KimBaeSC.IncreasedsusceptibilitytorheumatoidarthritisinKoreansheterozygousforHLA-DRB1*0405and*0901.Arthritisandrheumatism2004;50:3468-75.BarnetcheConstantinA,CantagrelA,Cambon-ThomsenA,GourraudNewclassificationofHLA-DRB1allelesinrheumatoidarthritissusceptibility:acombinedanalysisofworldwidesamples.ArthritisResTher2008;10:R26.LeeHS,KormanBD,LeJM,KastnerDL,RemmersGregersenPK,etal.GeneticriskfactorsforrheumatoidarthritisdifferinCaucasianandKoreanpopulations.Arthritisandrheumatism2009;60:364-71.MichaelssonE,MalmstromReisS,EngstromA,BurkhardtH,HolmdahlR.TcellrecognitionofcarbohydratesontypeIIcollagen.TheJournalofexperimentalmedicine1994;180:745-9.DzhambazovB,NandakumarKS,KihlbergJ,FuggerL,HolmdahlR,M.TherapeuticvaccinationofactivearthritiswithaglycosylatedcollagentypeIIpeptideincomplexwithMHCclassIImolecules.Journalofimmunology2006;176:1525-33.KildingR,WilsonAG.MappingofanovelsusceptibilitygeneforrheumatoidarthritisinthetelomericMHCregion.Cytokine2005;32:71-5.StastnyAssociationoftheB-c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