第8章(下)-分子生物学基本研究法.ppt

1、第六章 分子生物学研究法 （下）,2020/8/5,分子生物学-第5章,2,本章主要内容,基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片技术 其他分子生物学技术,2020/8/5,分子生物学-第5章,3,是一种以测序为基础定量分析基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。 SAGE的主要依据: 1.一个910碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。 2.如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。,6.1 基因表达

2、研究技术,1、基因表达系列分析技术（SAGE） P193 （serial analysis of gene expression）,2020/8/5,分子生物学-第5章,4,步骤： （1）选择特定的限制内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标签。 （2）将这些标签连接在一起、克隆和测序。 （3）根据其占总标签的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。（图P194） AE？TE？双标签？如何分离3端酶切片段？,2020/8/5,分子生物学-第5章,5,SAGE是基因表达定性和定量研究的一种有效工具，非常适合于比较不同发育状态或疾病状态的生物基因表达。 另外SAGE

3、能够接近完整地获得基因组表达信息，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。,2020/8/5,分子生物学-第5章,6,2. RNA选择性剪接,RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式（选择不同的剪切位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。 mRNA前体的选择性剪接，使一个基因翻译为多种蛋白质序列，极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度，是基因表达多样性的重要表现形式。,2020/8/5,分子生物学-第5章,7,2020/8/5,分子生物学-第5章,8,3、原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）,用标记的核酸探针，经放射自显影（放

4、射性同位素，如3H、35S、32P）或非放射（如生物素、地高辛等）检测体系（酶促免疫显色），在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 原位杂交是分子杂交的一种，是在切片上进行的，能显微定位 。 可分为：RNA原位杂交和染色体原位杂交。,2020/8/5,分子生物学-第5章,9,RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛 生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织 切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分 子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记 或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定 性定量分析。,2020/8/5,分子生物学-第5章,10,荧光原位杂交

5、(FISH)： 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 优点：不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。,2020/8/5,分子生物学-第5章,11,人肌糖原磷酸酶基因在11号染色体的定位结果。,2020/8/5,分子生物学-第5章,12,2020/8/5,分子生物学-第5章,13,4、基因定点突变（site-directed mutagenesis） 技术 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列。 常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体

6、能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。,2020/8/5,分子生物学-第5章,14,寡核苷酸介导的DNA突变技术（P198图6-6） 以PCR为基础：重叠延伸技术（P199图6-7） 大引物诱变法（P200图6-8） 以上三种方法虽不同，但原理都一致。,2020/8/5,分子生物学-第5章,15,1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术,已知序列的环状DNA,人工合成一段引物,变性,模板,定点突变,细菌转化,延伸诱变寡核苷酸引物,DNA聚合酶,筛选引入突变的环状DNA,2020/8/5,分子生物学-第5章,16,2、重叠延伸技术,正向诱变引物FM,反向引物

7、 R2,正向引物 F2,反向诱变引物RM,已知序列DNA模板,在重叠区发生退火,PCR3,使用引物F2和R2扩增,PCR4,全长突变DNA片段,形成全长双链突变DNA,反向互补,产物,产物,2,1,P C R,2020/8/5,分子生物学-第5章,17,3、大引物诱变法,PCR1产物,正向诱变引物（M）,反向引物（R1）,双链大引物,退火和野生型基因复性,PCR2,正向引物（F2）,退火温度PCR2PCR1,已知序列DNA模板,全长突变DNA片段,2020/8/5,分子生物学-第5章,18,PCR介导的基因定点突变方法的优势？ 1、突变体回收率高。 2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位 点

8、引入突变。 3、可在同一试管中完成所有反应。 4、快速、简便。,2020/8/5,分子生物学-第5章,19,6.2 基因敲除技术 P200 概念： 基因敲除技术（gene knockout)又称基因打 靶（gene targeting）。这种技术是通过基因工程 的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除， 或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲 入），然后从整体上观察实验动物，从而推测相 应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有 功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。,2020/8/5,分子生物学-第5章,20,基因敲除技术分为： 完全基因敲除：用同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶

9、基因活性。 条件型基因敲除：用定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 同源重组：是指发生在非姐妹染色单体之间或 同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或 分子之内的重新组合。,2020/8/5,分子生物学-第5章,21,插入基因包括正向选择标记基因和负向选择标记基因。 正向选择标记基因neor(新霉素抗性基因)通常被插入到靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重组置换靶基因最重要的功能域，以使靶基因彻底失活。 利用筛选培养基检测是否存在正向选择标记基因，可以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中。,（1）完全基因敲除策略,2020/8/5,分子生物学-第5章,22,负向选择标记基因HSV-

10、tk(疱疹病毒胸苷激酶基因)： 如打靶载体是随机整合到细胞基因组上时，HSV-tk基因也被整合到基因组上，故细胞就不能在含有负筛选药物(丙氧鸟苷)的培养基中存活。 疱疹病毒胸苷激酶蛋白可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性的核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。 如打靶载体是通过同源重组整合到靶位点上， HSV-tk不能被整合到基因组中，细胞得以在含有正负筛选药物的培养基中存活下来。（图见P203）,2020/8/5,分子生物学-第5章,23,图6-10 正负筛选法（PNS法)筛选已发生同源重组的细胞,2020/8/5,分子生物学-第5章,24,基本原理:,构建与靶基

11、因同源 (1015kb)的载体,外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择的标志,疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择,体外培养,新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选,将重组体导入ES细胞,存活的ES细胞,2020/8/5,分子生物学-第5章,25,真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重 组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干 细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载 体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。,2020/8/5,分子生物学-第5章,26,方法,表型分析,构建载体,同源重组,筛选X

12、被敲除的ES细胞,显微注射,回交得到X被敲除的动物,2020/8/5,分子生物学-第5章,27,显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。,2020/8/5,分子生物学-第5章,28,(2)条件型基因敲除,条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。,常用的条件型基因敲除有： 噬菌体的Cre/LoxP系统、Gin/Gix系统 酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统,2020/8/5,分子生物学-第5章,29,Cre重组酶：能介导两个含34bp

13、的LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间序列或基因被删除。 LoxP位点：是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，13bp反向重复序列是Cre酶的结合域。 首先通过同源重组把正向选择标记基因neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向的LoxP位点。 （图见P202）,2020/8/5,分子生物学-第5章,30,构建打靶载体,同源重组,筛选中靶ES,显微注射,杂交删除neor基因,特定阶段诱导Cre酶 切除目的片段,动物观察分析,Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序：,体外培养,2020/8/5,分子生物学-第5章,31,需消除

14、靶基因活性时： 通过与带有重组酶基因ES细胞杂交，可以把两个LoxP位点中间的DNA片段切除，使靶基因失活。 将标记基因的两侧也连入LoxP序列可在它影响靶基因转录时，将其删除。 从理论上说，可根据实验需要，设计在不同发育时期、不同空间任意敲除任何一个靶基因。,2020/8/5,分子生物学-第5章,32,T-DNA：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。 Ti质粒：是根癌农杆菌染色体外的物质，为双股共价闭合的环状DNA分子。 报告基因：是一种编码可被检测的蛋白或酶的基因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。,（3）植物基因敲除技术,利用农杆菌T-DNA介导转化

15、，将一段带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如插入目的基因内部或附近，就会影响基因的表达，从而使基因失活。,基因敲除的意义： 研究基因功能 转基因动物的制备 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物,2020/8/5,分子生物学-第5章,34,6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 1、酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system） 蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础. 酵母双杂交(yeast two hybrid) 技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的

16、与已知蛋白相互作用的未知蛋白。,2020/8/5,分子生物学-第5章,35,酵母双杂交由Fields在1989 年提出。其产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N 端1-174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA binding domain，BD)和位于C 端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD)。,2020/8/5,分子生物学-第5章,36,BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但 是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的 GAL4转录因子活性并可激活

17、启动子,使启动子下 游基因得到转录.,2020/8/5,分子生物学-第5章,37,Fields 建立了一个双杂交系统，DB与X蛋白融 合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白- 蛋白复合物，使GAL4 两个结构域重新构成，启 动特异基因序列的转录。 一般地，将DB-X 的融合蛋白称作诱饵(bait),X 往往是已知蛋白，AD-Y 称作猎物(prey),能显示 诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对 报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间 是否存在相互作用。,2020/8/5,分子生物学-第5章,38,2020/8/5,分子生物学-第5章,39,酵母双杂交技术的基本原理,已知蛋白编码

18、基因X,编码BD基因,cDNA不同片段Y,编码AD基因,诱饵基因,猎物基因,转化酵母细胞,报告基因,表达,不表达,X与Y编码蛋白有无相互作用,有,无,2020/8/5,分子生物学-第5章,40,正向选择基因neo的作用机理？ 通常被插入到靶基因功能最关键的外显子中， 或通过同源重组置换靶基因最重要的功能域，以 使靶基因彻底失活。 利用筛选培养基检测是否存在选择标记基因， 可以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中。 Cre重组酶的作用？ 能介导两个34bp的LoxP位点之间的特异性 重组，使LoxP位点间序列或基因被删除。,2020/8/5,分子生物学-第5章,41,LoxP位点？ 是由两个13

19、bp反向重复序列和中间间隔的8bp 序列共同组成。 13bp反向重复序列是Cre酶的结 合域。 Ti质粒？ 是根癌农杆菌染色体外的物质，为双股共价 闭合的环状DNA分子。 报告基因？ 是一种编码可被检测的蛋白或酶的基因，是 一个表达产物非常容易被鉴定的基因。,2020/8/5,分子生物学-第5章,42,酵母双杂交技术的意义？ 酵母双杂交是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。,2020/8/5,分子生物学-第5章,43,酵母转录因子GAL4的结构？ GAL4包括两

20、个彼此分离的但功能必需的结构域。 位于N 端1-174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA binding domain，BD)和位于C 端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD) 。,2020/8/5,分子生物学-第5章,44,2、酵母单杂交法（yeast one-hybrid） 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析 DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法。 特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上 的蛋白质 ，可在酵母细胞内研究真核生物DNA 与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直 接获得与靶序列相互作用

21、蛋白的编码基因。,2020/8/5,分子生物学-第5章,45,酵母单杂交技术最早是1993年从酵母双杂交技术 发展而来。 酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测 以实现对蛋白质间相互作用的研究。 酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测， 分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细 胞内的基因表达调控。,2020/8/5,分子生物学-第5章,46,真核生物的转录起始需要转录因子的参与。 这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功 能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激 活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA- binding domain, BD)和转录激活结构域 (activat

22、ion domain, AD). 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即 是一种典型的转录因子.,2020/8/5,分子生物学-第5章,47,基本原理： 将特定的顺式作用元件构建到最基本启动子的上游，把报告基因连接到基本启动子下游； 将GAL4 的DNA结合结构域（BD）置换为其它蛋白（待测转录因子），只要它能与顺式作用元件相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域（AD）激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。 可通过报告基因的表达将编码待测转录因子的基因筛选出来. 图P206 6-15,2020/8/5,分子生物学-第5章,48,基本操作过程为:,cDNA与已知酵母转录激活结构域（A

23、D）基因融合,导入酵母细胞,基因产物 （蛋白质）,顺式作用元件,激活Pmin启动子,报告基因得到表达,筛选阳性克隆,测序分析,cDNA替换了编码结合结构域(BD)蛋白基因,2020/8/5,分子生物学-第5章,49,该技术的应用特点？ 1.能筛选到与DNA 结合的蛋白质。 2.可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷 酸序列。 3.酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比 其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基 因表达调控的真实情况。,2020/8/5,分子生物学-第5章,50,4.免疫共沉淀技术,这是一通过抗体来特异性的识别候选蛋白质的方法 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与抗体

24、发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法，在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。,2020/8/5,分子生物学-第5章,51,靶蛋白抗体,固体基质,待筛选蛋白,低离心力沉淀或微膜过滤,亲和反应,反应体系,靶蛋白抗体,待筛选蛋白,相互作用,沉淀得到待筛选蛋白,2020/8/5,分子生物学-第5章,52,是利用双链小片段RNA(siRNA)高效、特异性降解细胞内源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。,5.RNAi技术（RNA interference，RNA干涉） P213,2020/8/5,分子生物学-第5章,53

25、,1998年，首次发现双链RNA被摄入细胞后，可高效特异性抑制同源的靶基因表达。 非哺乳动物细胞：较长的双链RNA可直接产生RNAi作用。 哺乳动物细胞：较长的dsRNA（double-stranded RNA, dsRNA）会导致非特异性基因沉默。只有大约21个核苷酸的siRNA才能有效引发特异性基因沉默。P213 图6-24,2020/8/5,分子生物学-第5章,54,RNAi作用机制,Dicer酶,双链RNA,siRNA （21 25个核苷酸的小片段双链RNA）,沉默复合体（RISC） 的形成,切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域,2020/8/5,分子生物学-第5章,55

26、,RNAi技术的应用：,与传统的同源重组基因敲除技术相比 高稳定性 高效率 易于操作 可实现多种基因突变,RNAi技术主要应用于基因功能研究或基因治疗及药物筛选。,2020/8/5,分子生物学-第5章,56,6.4 基因芯片及数据分析,基因芯片技术是生物芯片的一种。 生物芯片是高密度固定在固相支持介质（玻璃片/尼龙膜）上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、cDNA片段或多肽、蛋白质）的微阵列。阵列中每个分子的序列及位置都是已知的。 基因芯片上固定的是核酸类物质，主要用于DNA、RNA分析。,2020/8/5,分子生物学-第5章,57,基因芯片（gene chip） :利用点样机等机械装 置，

27、在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、 成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基 因杂交的一条DNA探针。由于芯片上有序地排列 着DNA探针，因此也被称为微阵列。,2020/8/5,分子生物学-第5章,58,基因芯片是能同时监测大量靶基因表达的 实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上 阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变 化规律。,2020/8/5,分子生物学-第5章,59,原理：在芯片上滴加样品后，在合适的条件下， 样品中含有的各种核酸片段就与相应的探针杂交。 由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的 荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量 成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共

28、聚 焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软 件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情 况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前 生命科学研究的热点之一。,2020/8/5,分子生物学-第5章,60,过程： （1）大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段 （2）用机械手将PCR产物点在玻璃板,变性,固定 （3）分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录 生成cDNA （4）分别用cy3（绿色）cy5（红色）两种荧光染 料标记两种cDNA （5）将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交 （6）激光扫描芯片杂交结果，计算机处理 （7）分析杂交数据 P215 图6-25,2020/8/5,分子生

29、物学-第5章,61,2020/8/5,分子生物学-第5章,62,2020/8/5,分子生物学-第5章,63,基因表达分析芯片 基因多态性分析芯片 疾病诊断芯片,2020/8/5,分子生物学-第5章,64,6.5 利用酵母鉴定靶基因功能（自学） 6.6 其他分子生物学技术,2020/8/5,分子生物学-第5章,65,1. 凝胶阻滞试验(EMSA),凝胶阻滞试验（EMSA)是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。是分离纯化特定DNA结合蛋白的经典方法。,2020/8/5,分子生物学-第5章,66,原理： 在凝胶电泳中DNA朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，没有结

30、合蛋白质的DNA片段跑得很快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。 当特定DNA片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该DNA可能与提取物中某个蛋白质分子发生了相互作用。,2020/8/5,分子生物学-第5章,67,步骤：标记待检测DNA片段-与细胞提取物温育-电泳-放射自显影技术显示条带位置 用来研究与蛋白质相结合的DNA序列的特异性。以及探针分子中与蛋白质直接发生作用的关键性碱基。,2020/8/5,分子生物学-第5章,68,方法：,同位素标记待测的DNA片段,细胞提取物,DNA-蛋白质复合物,探针DNA,温育,PAGE电泳,放射自显影,进行DNA凝胶

31、分析,2020/8/5,分子生物学-第5章,69,2.噬菌体展示技术,噬菌体表面展示技术(Phage Display Technology)是一种研究蛋白质相互作用的方法。根据蛋白质还可以得到相应的基因片段。,2020/8/5,分子生物学-第5章,70,感兴趣的蛋白质基因,噬菌体表面蛋白基因,插入到噬菌体载体上,分离出噬菌体,插入,感染大肠杆菌,捕获靶蛋白,基因表达蛋白质展示在噬菌体表面上,侵染大肠杆菌,筛选噬菌体,2020/8/5,分子生物学-第5章,71,3.蛋白质磷酸化分析,由蛋白质激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白质可逆磷酸化过程，是生物体内一种普遍且重要的调节方式，控制着众多的生理生化反

32、应和生物学过程。细胞生长发育、形态建成、细胞周期调控、基因表达、蛋白合成以及神经功能、肌肉收缩等都与磷酸化有关。,2020/8/5,分子生物学-第5章,72,研究目的：底物蛋白磷酸化和蛋白激酶活性检测。 蛋白激酶活性分析步骤（筛选激酶特异性底物） （1）获取底物蛋白和待检测蛋白激酶（组织提取；原核表达系统；真核表达系统） （2）进行体外磷酸化反应 P227,2020/8/5,分子生物学-第5章,73,蛋白激酶,底物蛋白发生磷酸化,蛋白质磷酸酯酶,底物蛋白发生去磷酸化,ATP或GTP,磷酸基团转移到底物蛋白,磷酸化与去磷酸化,2020/8/5,分子生物学-第5章,74,蛋白质磷酸化研究方法（电泳法）,底物蛋白,待检测的蛋白激酶上样,电泳,聚合到,SDS-聚丙烯酰胺凝胶,凝胶洗去SDS使蛋白质复