课题3　血红蛋白的提取和分离 (17).ppt

1、事故阅读：血液由_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _和_ _ _ _ _ _ _ _组成的血细胞血细胞里的蛋白质叫。属于细胞液，功能是运输O2和CO2。红细胞，血浆蛋白，内部，血红蛋白，1，基础：(1)蛋白质分离原理(2)蛋白质分离和鉴定方法(1)凝胶色谱法2)传记解冻方法(3)缓冲液的作用，1，蛋白质提取和分离原理的物理和化学性质差异1。分子的形状，大小2。电荷性质和多少3。溶解度4。吸附特性5。根据对其他分子亲和力分离的蛋白质的相对分子质量，利用网状结构的凝胶的分子筛作用分离。1 .概念：(1)凝胶色谱法(分配色谱法)，性质：小孔球体本质：多糖化合物示例：葡聚糖，琼脂糖，

2、2，原理：徐璐其他蛋白质通过凝胶时，相对分子质量相对较小，洗脱：从频谱柱顶部持续注入缓冲液，促进蛋白质分子的通量，3，具体过程，演示凝胶色谱法蛋白质分离过程的动画，1，凝胶色谱法蛋白质分离时分子量大蛋白A长，速度慢B长，速度快C长短，速度慢D长短，速度快D，2，相对分子质量不同的蛋白质，外酸调节缓冲剂的()可以制造可以使用的缓冲液。12，使用比例，在不同PH范围内，以弱酸和相应的强碱盐溶于水。H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等，3。问题：牙齿主题中使用的缓冲区金额为3360 _ _ _ _ _，其目的是？确保模拟胞内PH环境，血红蛋白正常结构和功能，观察(红色)和科学研

3、究(活性)，磷酸缓冲液，(3)，传记电泳-血红蛋白分离鉴定方法，1。概念：带电粒子作用过程。2 .原理：多肽、核酸等许多重要的生物大分子所具有的基团，在一定的PH时携带或携带牙齿基团。在电场的作用下，牙齿带电分子转移到定向电极。传记电泳在要分离的样品中利用各种分子和分子本身的差异使带电分子不同，从样品中分离各种分子。电场，移动，可分离，正电，负电，与电荷不同，电荷的差异，大小，形状，移动速度，影响蛋白质分子运动速度的因素，3，类型3360，琼脂糖凝胶电泳(大分子)，聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺及交联剂N，N-甲基双丙烯酰胺(N-甲基双丙烯)在引发剂和催化剂的作用下聚合而成的

4、具有交叉三维网状结构的凝胶。N、N-甲基双丙烯酰胺(交联形成)、丙烯酰胺和交联剂N、N-甲基双丙烯酰胺交联共聚反应，原理：在聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的迁移率取决于相同的因素。它拥有的纯电荷的数量和分子的大小，作用机制：SDS产生蛋白质()。用一条肽链聚合。SDS可以形成多种蛋白质和蛋白质-SDS复合物，SDS携带的负电荷量远远超过蛋白质分子的原始电荷量。因此，不同蛋白质之间的电荷差异被掩盖，传记电泳迁移率完全取决于。分子大小，(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，完整变性，2，实验操作实验阶段，血液成分，1，样品处理，3，精炼，4，纯度检查，2，粗分离，除杂血浆蛋白，低速短时间，5倍体积的生理盐水，

5、3次，上清液不再呈黄色显示，表明红细胞的洗涤干净，可以保持生理盐水红细胞的渗透压不破裂。如果红细胞提前破裂，则混合血红蛋白及杂质血浆蛋白，以提高分离的难度。(2)血红蛋白释放，1，在血红蛋白释放过程中，冲洗的红细胞里放了什么物质？2、为加快发布过程，采取了哪些措施？(使用磁搅拌器充分搅拌)，目的分析：蒸馏水的作用是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _充分混合的目的是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

6、，红细胞吸收率上升，细胞膜溶解，红细胞破裂加速，分离过程，红细胞混合液，(3)分离血红蛋白液，(1)层(顶部):甲苯层(无色透明)，2层(中上方):脂溶性物质沉淀层(白色薄层)把透析信封放在溶液里透析。(2)透析的原理是：(3)透析的目的是让透析、玻璃纸、肠、膀胱膜、磷酸缓冲、透皮袋自由进出小分子，把大分子放在口袋里，从样品中清除分子量小杂质。透析过程动画演示。制作底部插头：钻一个洞，挖一个凹洞，挖一个移动管头，盖上尼龙网，用100颈尼龙纱包起来，插入玻璃管的一端。塔插头制作：钻孔安装玻璃管。组装：根据上述三者的位置将它们组装成一个。安装其他子结构。凝胶频谱柱的制作，(2)凝胶频谱柱的填充，凝

7、胶的选择：A，材料：交叉葡聚糖凝胶(G-75)。b，意思：“G”表示凝胶的交叉程度、膨胀程度和分离范围。75表示凝胶的得数值，即每次凝胶膨胀时吸收7.5克。凝胶的预处理：计算了一定量的凝胶浸泡在蒸馏水或洗涤剂液中，充分溶解后配制凝胶悬浮液。凝胶频谱柱的填充方法：A，固定：将频谱柱装置固定在支架上。b，充电：一次慢慢地将凝胶悬浮液倒入彩色频谱柱，充电时轻拍彩色频谱柱，使凝胶均匀填充。注：p70 1，填充凝胶时尽量紧密，减少凝胶颗粒之间的间距。2.填充凝胶柱的时候泡沫存在，就会渡边杏存在。因为泡沫扰乱了洗涤剂中蛋白质的溶出顺序，降低了分离效果。，(2)凝胶频谱柱的填充，洗涤平衡：安装后连接缓冲液洗

8、涤剂瓶，在50cm的高工作压力下用300ml的20mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)充分洗涤平衡12h。把凝胶填满。注意：1，不要让液面低于凝胶表面。否则会混合泡沫，影响分离效果。2、不会发生洗脱流，可能发生凝胶颗粒显露的现象。(2)凝胶频谱柱的填充，50厘米高，缓冲液调节：打开底部出口，将柱内的缓冲液慢慢降低到与凝胶面相同的水平，关闭出口。透析样品：吸管将1ml样品放在颜色频谱柱的顶部，滴样品时吸管喷嘴贴在管壁上进行移动加形，同时注意不要破坏凝胶面。重新调整缓冲液：添加样品后，打开底部出口，将样品渗透到凝胶床内，样品完全进入凝胶层后，关闭底部出口。将PH=7.0的20MMMOL/L的磷酸

9、缓冲液小心地放在适当的高度清洗。连接缓冲液洗涤瓶，打开底部出口洗涤。收集：红色中的蛋白质接近频谱柱底部时，用试管收集流出液，每5毫升收集试管继续收集。(3)添加和洗脱样品，正确的追加工作为1，不要碰，破坏凝胶面。2、贴纸加样品。3、让吸管喷嘴沿管壁移动。添加透析样本，频谱柱制作成功标志：红色带均匀移动，(4)，纯度鉴定：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，注意事项，1。红细胞洗涤：洗涤次数太少，会渡边杏。低速短时间离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法，还可以去除微生物和气泡。3。彩视柱的充电：充电尽可能紧密。没有气泡，洗脱液被切断后渡边杏。4.颜色频谱柱成功标记：红色条带均匀移动。处理的血液样本离心后是否分

10、层，如果分层不明确，则清洗次数少，可能是血浆蛋白去除失败的原因。此外，离心速度过高，时间过长，白细胞和淋巴细胞会一起沉淀，没有纯红细胞，会影响后续血红蛋白提取的纯度。实验结果分析和评价，1，你完成血样处理了吗？您能说明处理后样品发生了什么变化吗？2，你充电的凝胶柱里有气泡吗？你的色谱成功填充了吗？你是怎么判断的？1，凝胶是半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁边放置垂直于凝胶柱的荧光灯，以确保凝胶均匀填充。2、添加蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖等大分子的着色物质，观察带状移动。如果丝带均匀、窄、平坦，就表明凝胶频谱柱性能良好。3.颜色栏上有花纹或起泡沫，轻敲柱子去除泡沫，不能去除的时候，要重新安装柱

11、子。如果凝胶频谱柱填充成功，分离工作也正确，可以清楚地看到血红蛋白红色带均匀、狭窄、平坦、洗涤剂慢慢流出。如果红色带扭曲、混乱和扩大，则意味着分离效果不好。这与凝胶频谱柱的填充有关。3，能观察蛋白质的分离过程中红色区域的运动吗？请解释红色乐队的动作，并相应地判断分离效果好吗？教育反馈，1凝胶色谱法是根据()分离蛋白质的有效方法。a分子的大小B起到了相对于分子质量的大小C带电荷的D溶解度2缓冲液的作用。在一定范围内抵抗外界影响()，基本上是不变的。a温度B pH C渗透压D氧浓度3传记灵动是指在电场作用下向带电荷的电极移动的传记粒子。a与B相反，C以D为基准面对4。哺乳动物和人的成熟红细胞中，与

12、氧气输送有关。A血红蛋白B肌球蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白，B，B，B，A，5血液在血浆和各种血细胞中含量最高。a白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6为防止血液凝固，应事先在采血容器中添加抗凝血剂。A.NaCl B .甲苯c .蒸馏水d .柠檬酸钠7将搅拌混合液转移到离心管后，可以清楚地看到试管中的溶液分为4层。其中3层是()A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白水溶液D其他杂质的深色红色沉淀物，C，D；(2)在a装置中，b是血红蛋白溶液，a是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _；C溶液在乙设备中的作用是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

13、_ _ _ _ _ _。(3) a装置_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 将血红蛋白分隔到乙设备时_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _，运输练习：提取和分离血红蛋白的部分实验装置，如图所示，回答以下问题：1。a .它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。使用的凝胶实际上是一些小孔球体，牙齿小球体大部分由多糖化合物组成，小球体内部有很多贯穿通道。当含有各种分子的样品溶液缓慢流动时，每个分子在色谱柱内进行两种茄子不同的运动，即垂

14、直向下运动和不规则扩散运动。相对大的分子质量的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒，相对小的分子质量的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过长度长，移动速度慢。因此，样本中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象也称为分子筛现象。1.凝胶色谱法蛋白质分离原理是什么？课后练习，在A :一定范围内对抗少量江珊、强碱或少量稀释，对溶液pH没有发生明显变化的作用称为缓冲作用。具有缓冲作用的溶液称为缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一两个茄子缓冲剂溶于水而制成的。调整缓冲剂的比例，可以徐璐制作其他pH范围的缓冲液。缓冲溶液作用保持反应体系的pH值不变。在体内执行的各种生物化学过程都在正确的pH上进行，并由氢离子浓度严格控制。为了在实验室条件下准确模拟生物体内的自然环境，体外生物化学反应过程与体内过程完全相同的pH .2。什么是缓冲溶液，它的作用是什么？原理：传记游泳是指在传记电场的作用下电流的粒子移动过程。许多重要的生物大分子，例如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等，都有一个在特定pH上带正电或负电的可分离基团。在电场的作用下，