第四章抗生素效价的微生物检定法 第八节 一剂量法(选讲内容) 第九节.ppt

1、第四章：抗生素效价的微生物检定法第七节三剂量法第八节一剂量法(选择内容)第九节浊度法技术，授课者：王穗福(高级讲师)苏惠虹(助手讲师)广州市医药专科学校，第七节三剂量法，三剂量法是指高、中、中3剂量比2剂量多1种抗生物质量，可提高结果的准确性选择三剂量法时，要求剂量的大小必须在直线关系的范围内。 另一方面，效价修正公式pt=LG-10.1292 (t3t2t1- s3- s2- s1)/(s3t3- s1- t1) 100 (410 )所选择的两个盘必须为6个以上，每个盘都有间隔培养后，精密测定各制菌轮直径，可靠性测定后，符合规定，按效价修正公式修正效价。 如果不符合规定，请重试。 三、效价核

2、算和误差分析可以参考中国药典(2005年版)附录内容的例题。 第八节一用量法(选择内容)、一、设定修正原理和修正算式本法系使用已知效价的标准品溶液制作标准曲线，在相同条件下测定供试品溶液的抗菌轮径的平均值后，求出与标准品溶液的抗菌轮径的平均值之差，则可以在标准曲线上直接得到供试品溶液的浓度，换算效价，因此，标准曲线法由式(42):lgM=(1/9.21DT)r2lg(C.4DTH )可知，抗生素总量的多少受到最低抗菌浓度(c )培养基厚度(h )的扩散系数(d )和细菌的生长时间的影响，同时公式(41)r2=4DTlnM-lnC-ln(4DTH ) 因此，在测定效价时必须消除这些影响，得到正确

3、的结果。 为了消除这些影响，可以使用相对效价设定修正法，即同时对照测定标准品的方法。 其补正方法为，将标准品抗菌环直径设为S1 :将标准品的总量设为m。 供试品的抗菌环径为T1:供试品的总量为m。 lgm=(1/9. 21dt ) s 21lg (c.4 d th ) (411 ) lgm=(1/9. 21dt ) t 21lg (c.4 d th ) (412 )。 因此，两式减法时，lgm/m=(1/9. 21 dt ) (t 21-s 21 ) (413 ) lgm/m为供试品与标准品的效价核对数，=M/M时： lg=()，这是管盘法的标准曲线法的基础。 中的组合图层性质变更选项。 效价

4、与抗菌环半径的(或直径的)平方呈直线关系，发现其直线方程式为lgYaXb。 对照供试品和标准品进行测定，b可以消除，lga(X，x )，即效价的对数等于倾斜供试品和标准品的抗菌轮径的差数。 标准曲线的基础是测定效价。 即，如果使用： lg效价=(斜率)(供试品的抑菌径标准品的抑菌轮径) (415 )上式得知斜率，则可以求出lg效价。 为了消除测定皿之间的差异，在各皿的含菌培养基中放置6片不锈钢小管(简称为小钢管)，在间隔的3片中放入有标准品的特定浓度Ck，它们得到的抗菌轮径的平均值为，在其他3片中放入标准品的中心浓度Co，它们得到的抗菌轮径的平均值为0。像fk=yky0 (416 )这样采用的

5、自我对照方法，如果在某个皿的条件下增大抗菌环，则k和0变大到相似的程度，反之亦然。 因此，在fk中的盘之间的差必然小于在k中的盘之间的差。 因此，f值也应该与抗生素浓度的对数值呈线性函数关系。 即f=ax b，因此只能作成标准曲线。 二、标准曲线制定和测定方法1 .标准曲线制定中心浓度的选择：在各种抗生素对数浓度(给药量)和抗菌环(反应)关系的直线范围内，首先选择中心浓度Co，浓度引起的抗菌直径大小为1617.5mm，用容量瓶稀释制备溶液。 通常取整数。 各剂量用等比级数稀释，给药距离一般为3种：1:0.8 1:0.88 1 :0.85。 中心浓度和剂量距离决定后，应该进一步计算中心线量接近的

6、高低2个浓度C0 1和C0-1。 例如Co=10u/ml、剂间距离1:0.8； r=(C0 1)/(C0-1)=1/0.8，C0-1=0.8(C0 1 )。 另外，C0 1/C0=C0/C0-1、C0 1=102/C01导出为C0-1=8.94U/ml C0 1=11.18U/ml，其他各量以等比级数分别根据试验结果求出各点的位置，在半对数坐标表上，将各点连接成一条直线，直线试验器材的准备和操作见本章第四节。 在此，以链霉素的效价测定为例进行说明，精确称量链霉素标准品，用磷酸盐缓冲液稀释成各种浓度Ck(k1-K8 )，如表46所示。 同时调制标准品的中心浓度C01.0U/ml、剂量比1:0.8

7、8，取准备好的24只双碟，分成8组，每组分成3只。 在各组各皿内间隔的3片小钢管内分别滴加标准品k1-8、即0.641.56Uml溶液，在其他3片小钢管内全部滴加标准品的中心浓度Co即1U/ml溶液。 如图46所示，培养1618 h后，各制菌环的直径各测定一个。 对每个组求出基于3个双盘中心浓度Co的抗菌环直径的平均值Yo及基于C1C8的抗菌环直径的平均值，即k (Ck=1-8)。 Fk=ko，分别修正Fk值，在8组双皿中得到的F1-8的8个反应残奥表，以Fk值为横轴，以对应的抗生素浓度对数为纵轴，以方纸上标点符号：或者以Fk值为横轴，以对应的抗生素质量Ck为纵轴，在双周半对数图上连接标点符号

8、3 .供试品的效价测定：取标准品配制中心浓度的标准液，取供试品，估算效价后用缓冲液稀释成与标准品的中心浓度相同的供试品。 放置了准备的6张小钢管的双盘一般为3张以上，在各个双盘上，在有间隔的3张小钢管上分别滴下中心点浓度的标准液，在另外3张小钢管上滴下供试液。 在规定条件下培养后，测定各抗菌环的直径。 分别求出标准液制菌环直径的平均值0和供试液制菌环直径的平均值yk，算出yk-y0的差数(fk )。 由此，当在标准曲线上读取供试品的浓度时，能够转换为供试品中包含的效价U/ml，也能够代入直线回归式计算供试品的效价。 三、统一修正处理式1 .标准曲线的直线回归通过一剂量法的效价测定制作的标准曲线

9、，理论上由剂量(lgM )和反应(f )构成的点在一条直线上，但实际上由于存在生物差等因素，各点最终都稍微偏离该直线，直线回归最佳的直线回归式： 1 如果x增减1单位，则y增减平均b单位，这是由各点和(x，y )组成的倾斜的平均倾斜，因此用该平均倾斜(即回归系数b )校正试验品的效价，克服了人为描直线的缺点，准确地进行实验。 求b的公式是，b=(xy-xy)/(x2-xx) (418 )，2 .的可靠界限即使几个实验数据不是直线关系，也可以用直线回归的方法求直线。 此时的回归系数并不表示这些实验数据是否真的存在直线关系。为了验证实验的各点是否符合一条直线的密度，应用线性测试方法，即通过实验求b

10、值，估计评价整体可靠性限制，对实验有客观分析。 yyb (x-x ) (419 ) sy.x=(y-y )/(n-2 ) (420 ) sb=syx/(x-x )2(x sy.x 3360 )误差项的标准偏差Sb:回归系数的标准误差：综合回归系数t0.05的自由度为n-2，y值为y和b的两个统计3 .一剂量法的效价修正计算可以使用下式3360lgr=(y-y8)/b，统一修正计算例链霉素效价测定，教科书，图48 :一剂量法测定统一结果图，美国药典一剂量法YJF-Excel统一修正软件的统一修正结果表，难题解答，1 .标准品式中的w为取标准品或供试品的重量(mg )； v是溶解标准品或供试品制成浓溶液时使用的容量瓶的体积量(ml )； c是标准品或供试品的浓溶液的浓度(U/ml或g/ml )； p是标准品的纯度(单位数)或供试品的估计效价(U/ml或g/mg )。 如教科书例题： W=50100068373206mg方法二厂多采用该方法测定的样品量mg数表示的单位数1000加溶液的ml数1000uml作为表示单位628umg的抗生素，测定50mg时则采用506281000314ml1000uml的母液。 修正练习题，制备含有1新霉素标准品溶液1000 U/ml的