实验六高效液相色谱法.ppt

1、高效能液体色谱法(HPLC)，20.1.1高效能液体色谱法的建立与开发，高压高速现代高效能液相色谱于1967年上市，高效能液体色谱法(HIGH)，薄壳填料，柱效果为每公尺10003000托盘数，510公尺球和无定型微粒硅胶，每公尺560，000、新的分离模式和方法增加，基本特性1。高效、高速、高灵敏度、高选择性2。填充物粒子大小及流动相特性影响频谱柱效应3限制运行条件1。流动相对分离选择性影响2。柱子外部效果3。工作压力复盖范围大，20.1.2。1.吸附色谱(adsorption Chromatography) 2。分配色谱3。离子交换色谱(ion-exchange chromatograph

2、 y)，20.1.3。高效液相色谱法分类和正反色互补体系根据固定相和液体流相对极性的差异，有正色谱和反色谱两种茄子颜色互补体系或方法。反相色谱和正常色谱的主要区别是流动相和固定相的相对极性，最初在液相分配色谱中形成，现在广泛用于其他各种色谱方法。上述每种颜色频谱类型都可以进一步分为几种茄子的不同颜色频谱方法。这些方法可用于分析分离，每种颜色频谱方法也可用于在相关领域应用互补。20.1.3。高效液相色谱法分类和正负色谱系统，现代高效液相色谱采用310m柱填料，高压泵必须提供数十MPa或数百个大气压柱电压，以实现适用的流动相流量。因此，HPLC设备比其他类型的色谱复杂且昂贵。20.2。高效液相色谱

3、，HPLC图表，20.2。高效液相色谱，现代高效液相色谱包括一个或多个流动相存储装置，通常是玻璃瓶。每个存储瓶体积5002000mL。低液瓶的位置要比泵体高，才能保持一定的液静压力，泵运行时，通过放流阀可以轻松排出溶剂和泵体中残留的微量气体。贮藏期经常装有溶于溶剂的氧气、氮等气体装置，这种溶解性能形成气泡，从而扩大光谱，妨碍探测器正常运行。溶剂脱气主要有两种茄子方法，一种是真空或超声波脱气。另一种是惰性气体，如氦和氮，把溶解在溶剂中的空气拿出来。贮罐的溶剂导管入口包含过滤器，通过从溶剂中进一步去除灰尘或微粒渣，防止泵、样品阀或频谱柱的损坏。20.2.1。流动相容器和溶剂处理系统，通用HPLC注

4、入泵系统的基本要求是提供(50-500)105Pa的柱前液压。输出没有脉动的恒定流。流速范围0.1-10 ml/分钟；流量控制精度大于0.5%；系统组件防腐(密封性好的不锈钢或氟塑料)。高压泵产生的液体高压没有爆炸的危险。因为液体的压缩性很小。最重要的是系统密封性能好。目前常用的三种茄子类型的注入泵：往复活塞泵、气动放大泵、螺旋注射器泵各有优缺点。往复活塞泵，20.2.2。高压泵系统，1 .马达，2。往返凸轮，3。密封柱塞，4 .进气排水单向阀，5 .溶剂入口，6。脉动阻尼器，7。频谱柱、高效液相色谱柱比气相色谱柱(约530厘米)短得多，因此柱扩展(也称为柱外效应)牙齿更为明显。柱外部扩展是频

5、谱柱外部因素引起的峰值扩展，主要是样品系统、连接管道和探测器上的死卷。柱外部宽度除以柱前面和柱后面的宽度。样品系统是引起柱前扩张的主要因素，因此在高效液相色谱法中，对样品技术的要求比较严格。示例阀，20.2.3。样品系统、6个旋转样品阀图表、频谱柱是液相色谱的心脏部分，包括柱管和固定相两部分。柱管材料包括玻璃、不锈钢、铝、铜和内衬光滑的聚合物材料的其他金属。玻璃管的耐压有限，金属使用较多。一般频谱柱长530厘米，内径45毫米，凝胶频谱柱内径312毫米，内径大，可达25毫米以上。通常在分离之前有前柱。前柱的填充物与分离柱完全相同。这样，清洗溶剂通过前柱固定床饱和，通过分离柱时不再脱下固定床。确保

6、分离的性能不受影响。20.2.4。高效液相色谱柱，1 .根据内径的不同，大小类型可分为四种茄子类型：普通分析柱、准备或核销比柱、小内径或微直径柱以及毛细管柱。20.2.4。高效液相色谱柱，2 .保护柱，通常在分析柱前安装短保护柱，不仅可以从溶剂中去除微粒杂质和污染物，还可以从样品中去除不能与固定结合的成分，保护更昂贵的分析柱，延长使用寿命。3 .严格控制柱温度调节器、频谱柱的温度，可提高再现性，更好地分离色谱。液相色谱中有两种茄子基本类型的检测仪。一种是溶质性探测器，只对紫外线、荧光、电化学探测器等分离成分的物理或化学特性做出反应。另一类是对样品和洗脱液的总物理或化学性质、属于这些探测器的差分

7、折射、电导检测器等做出反应的整体检测器。20.2.5。液相色谱检测器，l .光吸收检测器：紫外线吸收检测器，光二极管阵列检测器，红外吸收检测器2。荧光探测器3。差动折射率检测仪4。蒸发光散射探测器5。电化学探测器，20固体是二氧化硅基质，7 .O1081 .能承受O109Pa的高压，能制造不同直径、形状、孔隙率的粒子。在二氧化硅表面结合各种官能团，就是结合固定床，可以扩大应用范围，这是目前使用最广泛的固定床。硬胶主要用于离子交换和尺寸排斥色谱，由聚苯乙烯和二乙烯苯基交联制成。最大允许压力为3.5108Pa。固定床按孔深度分类，可分为表面多孔和整体多孔固定床。20.3。在高效液相色谱固定相及流动

8、相、高效液相色谱中，流动相是液体，因此在成分上具有亲和力，参与固定相对成分的竞争。因此，正确选择流步骤会直接影响组分离度。对流动相溶剂的要求为1。化学惰性保证了固定相及分离组和无化学反应柱的稳定性和分离的再现性。2.为了便于分离组和溶剂回收，沸点低的适用物理性质低粘度有助于提高电导率和分离速度，降低柱前压力。为了减少UV探测器的低响应，提高检测灵敏度，对弱或无紫外线吸收等样品具有适当的溶解能力等。3.溶剂清洗和更换方便，毒性小，纯度高，价格便宜，操作和安全方便。20.3.2。液相色谱流动相，20.3.2。液相色谱流动相，20.4。吸附色谱(adsorption chromatograph y)

9、，20 . 4 . 1；线性容量、机械性能、不膨胀、大部分样品和化学反应等硅胶优点很多，因此硅胶使用量最大。高效液相色谱法中，表面多孔型和整体多孔型均可用作吸附色谱的固定相，填料均匀，粒度小。洞浅的优点可以大大提高柱子的效果。但是表面多孔型由于样品容量小，目前使用最广泛的是全孔微粒填充物。当流化床通过固定相(吸附剂)时，吸附剂表面的活动中心必须吸附流动相分子。另一方面，如果样品分子(X)通过流动流入柱，只要在固定相上保持一定程度，就要替代吸附的流动常溶剂分子的数量。据此，在固定相表面发生了竞争吸附：20.4.2吸附色谱分离机制，研究了应用最广泛、应用最广泛的高效液相色谱类型。可分为液-液色谱和

10、化学键色谱。电子是早期主要分配色谱类型，是物理吸附涂层固定液，是多孔载体表面的固定相。后者以结合相为固定相。也就是说，化学键合固定床接触载体或基质表面。化学键联色光谱成为占绝对优势的分配颜色频谱类型。20.5。在分配色谱、液-液相色谱中，流动相和固定相是液体，各种样品类型的分离分析(极性和非极性、水溶性和(1)分离原理液体分配色谱的分离原理基本上与液体萃取相同，在两种不能徐璐溶解的液体中)不同之处在于，液-液色谱的分布在柱上进行，因此这些分布平衡可能会重复多次，因此，将发生每个组件的差异移动，提高分离效率，从而使各种复杂组件分离。(2)固定相比较简单，因为液相色谱的流动参与了选择竞争。只要使用

11、几个茄子极性不同的固定液，就可以解决分离问题。为了更好地解决固定液在载体上丢失的问题。有了化学键接合固定床。它是通过化学反应结合将各种有机基团连接到载体表面的方法。取代固定液的机器渍，它的出现是液相色谱法中的重大突破。那是目前使用最广泛的固定床。约3/4以上的分离分析在化学键联固相进行。(3)流化床在液相色谱中避免固定液的损失。对流动相的基本要求之一是流动相和固定相尽可能不溶解，流动相和固定相的极性差异显着，越好。根据使用的流动相和固定相的极性图，分为正常分配光谱和反向分配光谱。如果使用流动相的极性小于固定相的极性，则称为正常分配光谱，适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大

12、的后流出。如果流动上的极性大于固定上的极性，则称为逆相分配光谱。它适用于双极化合物的分离，其流出顺序与正色报相反。牙齿方法是利用离子交换原理和液相色谱法技术相结合测定溶液中正离子和负离子的分离分析方法。在溶液中可以电离的物质通常可以用离子交换色谱法分离。不仅可以用于无机离子混合物的分离，还可以用于氨基酸、核酸、蛋白质等有机物的分离。因此，适用范围更广。20.6。利用离子交换色谱、离子交换色谱法、不同测量离子对固定相亲和力的差异进行分离。固定相使用离子交换树脂，树脂中分布着与固定电荷基团有利的平衡离子。分析物质电离时产生的离子可以与树脂中可分离的平衡离子反向交换，更换反应为阳离子更换：负离子更换

13、：20.6.1。离子交换平衡，体积排斥或排斥色谱(size-exclusion che SEC piller)是微粒均匀网状多孔凝胶材料。大于充填材料平均孔径的分子无保留地排出孔外，最先被冲洗。分子体积小于孔直径的分子完全渗透到孔中，最终冲洗。牙齿之间，中间大小体积分子渗入孔内，由于渗透能力差异，维持有所不同，并根据分子体积生成分子等级。在一定程度上与分子形状相关。因此，SEC分离是凝胶固定相孔内溶质分子体积差异引起的抗逆性及渗透性大小。20.7。体积排除色谱，20.7.1。根据分离原理、凝胶色谱法原理、分离类型选择1相对分子质量选择相对分子质量很低的样品，其挥发性好，适合气相色谱。最适合标准液相色谱类型(液体固体、液体和离子交换色谱)的相对分子量范围为2002000。对于相对分子质量大于2000的样品，最好使用尺寸电阻法。2根据溶解度，明确选择水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中样品的溶解度是有用的。如果样品能溶于水，最好采用离子交换光谱。如果样品可以溶于碳氢化合物(如苯或异辛烷)，则可以使用液-固