胰酶消化贴壁细胞ppt课件.ppt

1、贴壁细胞的消化和处理及注意事项、贴壁细胞：必须附着在支持物表面才能在体外生长。例如CHO细胞。消化：将分散的组织或粘附的培养物从彼此或培养基中分离出来，形成单细胞或小细胞群的操作。2。粘附细胞的消化。贴壁细胞在培养瓶中生长成致密的单层后，没有足够的空间进一步生长，培养基中的营养成分被消耗得更多。同时，积累了更多的代谢废物，需要在单独的瓶中培养、扩增和传代培养。粘附紧密的细胞，如Hela、HepG2、CHO等。需要用细胞消化液消化才能脱落、分散和扩展瓶子。常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸等。3.主要消化方法有：1 .酶消化(胰蛋白酶)；2.离子螯合剂；4.1.酶消化(胰蛋白酶)；1)胰蛋白酶

2、消化原理：胰酶是一种蛋白酶。通过降解特定位置的蛋白质，细胞膜和培养皿壁连接处的蛋白质被降解和分离。此时，由于细胞内部骨架的张力和培养液的表面张力，细胞变成球形。用于细胞消化的胰蛋白酶通常在0.25的工作浓度和7.2-7.4的酸碱度下使用。5，2)酶消化法的操作过程：(以下操作必须严格按照无菌操作的要求进行)，将细胞瓶中生长成致密单层细胞的原始培养液丢弃；根据细胞瓶的大小(取决于培养容器的大小)，以0.5毫升或更大的体积加入0.25毫升胰酶溶液，进行完全渗透；通常，消化时间约为1至3分钟。当瓶底从半透明(细胞单层连接成碎片)变为点状透明(出现微小缝隙)时，胰酶被丢弃，加入适量血清培养基停止消化，

3、并将其吹散。7，图片：CHO贴壁细胞，8，培养48小时后，成为致密的单层，9，加入0.25%胰蛋白酶后，细胞逐渐缩小变圆，细胞间隙增大，不再致密；10、细胞明显萎缩变小，细胞间隙增大，不再致密，部分细胞保持正常形态，部分细胞萎缩变圆。11、细胞基本上收缩并变圆，当细胞被吹倒时，12、细胞完全收缩并变圆，胰酶应被丢弃，细胞可在加入培养基后通过摇动从细胞瓶壁上洗掉，细胞悬液可通过吸管吹走然后传递，13、经验后，可以用肉眼观察附着在壁上的半透明细胞层以判断消化程度。如果你消化得太多，你会看到许多细胞脱落并随着废弃的胰酶溶液流失，甚至导致细胞破碎。也可以在倒数第二步和第三步中丢弃胰酶，并继续使用瓶中剩

4、余的胰酶，以达到最后一步的消化水平，这有点太多，影响很小。14.注意事项：1溶解后一周内，使用冰箱4中储存的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶可能在4点开始降解。如果在室温下放置超过30分钟，它将变得不稳定。2.在使用胰酶细胞消化液的过程中，应特别注意避免细菌污染。胰酶细胞消化液的消化时间不宜过长，否则细胞扩散后会生长不良。消化不充分使得细胞很难从瓶壁上吹下来，反复吹也会损害细胞活性。4.37: 00时，胰酶活性最强。16，5。溶液中的Ca2、Mg2和血清中的非特异性胰蛋白酶抑制剂会降低胰蛋白酶的活性，因此加入血清培养基可以停止反应。17.用胰蛋白酶消化后，细胞仍会结块。可能的原因是什么？消化时间不够

5、；吹得不够强；胰酶消化液的浓度不够；胰酶本身；细胞密度高；离子螯合剂：(乙二胺四乙酸)，1)乙二胺四乙酸消化原理：乙二胺四乙酸是一种螯合剂，因为许多结合到细胞表面培养皿上的蛋白质携带Ca2或Mg2，而乙二胺四乙酸螯合Ca2或Mg2，从而加速细胞从培养皿中分离。19，2)使用乙二胺四乙酸消化液的注意事项，1。常见浓度约为0。3.乙二胺四乙酸能显著影响酸碱度，并且不会被中和，因此消化的细胞应该用PBS洗涤一次，20，适用范围，因为乙二胺四乙酸不破坏细胞表面分子，而只与Ca2和Mg2螯合。因此，它适用于待检测细胞表面分子的细胞消化。细胞保存是细胞保存的主要方法之一。低温保存技术是将细胞低温保存在-1

6、96液氮中，使细胞暂时脱离生长状态，保持其细胞特性，必要时将细胞复苏进行实验。细胞复苏：解冻冷冻细胞，然后传代培养。为了获得良好的冷冻保存和复苏效果，我们必须了解以下问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂的冷冻温度、24、1、冷冻速率(指冷却速度)是活细胞能否冷冻到可永久保存的温度的主要因素。如果冷冻速度太快或太慢，细胞将会受损。只有以最佳的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最佳的冷冻效果。25，2，再加热速率再加热速率是指细胞复苏过程中温度升高的速率。当冷冻保存的细胞复苏时，不适当的复温率也会降低冷冻保存的存活率。一般来说，回温速度越快越好。在37水浴中，复温应在12分钟内完成。防冻剂防冻剂是能够保护

7、细胞免受冷冻损伤的物质，通常被添加到某些溶液中以制备成防冻剂。常用的冷冻保护剂：27、4、冷冻温度是指能长期保存细胞的深低温。在这个温度下，细胞的生化反应极其缓慢或停止，但经过长期保存和恢复，它们仍能保持正常的结构和功能。从实用和效益的角度来看，液氮温度(196)是目前最好的冷冻保存温度，而28，是一种渗透性保护剂，它能迅速渗透到细胞内，提高细胞膜对水的渗透性，降低冰点，延缓冷冻过程，并使细胞内的水在冷冻前排出细胞，在细胞外形成冰晶，从而减少冰晶对细胞的伤害。它的浓度必须等于10%，即使在低温下对细胞也是有毒的。一些细胞不能使用二甲基亚砜，但甘油。29，细胞冷冻保存程序，1个细胞在冷冻保存前24-48小时传代培养，2个细胞处于指数生长期，2个细胞被胰酶消化，然后加入适量的培养基，吹入细胞悬液3中，加入新生牛血清4并灭菌，过滤，5混合均匀，30，6，将悬液加入灭菌的冷冻管中，1-2 ml/管，密封，并置于标明细胞名称的4度冰箱中。30分钟后转移至-20冰箱，30分钟后转移至液氮口，数小时后转移至液氮保存。8.使细胞复苏，检查它是否活跃。31.细胞复苏程序，取出储存的细胞，在37水浴中快速融化，然后直接用完整的生长培养基平板培养细胞。1