人源化抗体与单克隆抗体制备的主要方法PPT课件.ppt

1、抗体的生物学活性，1 )特异性结合抗原，2 )补体，3 )结合Fc受体，4 )胎盘，5 )免疫调节，SCID，特异性结合(rag-1/2 ) 用requiredforsynthesisofthefunctionaligandtcrthatcharacterizematurebandt抗原对动物进行免疫而得到的动物血清(抗血清)是由体内抗原物质上的多个抗原表位(from multiple plasma 由于是分别诱导和响应多个不同的b细胞克隆后产生的多个抗体，因此称为多克隆抗体。 通常是指一株b淋巴细胞杂交瘤增殖扩张的单细胞克隆产生的高度均匀且高度特异性的抗体。单克隆抗体、Monoclonal

2、antibody、1975 withatechniquedevisedbykhlerandmilstein (forwhichtheywereawardedanobelprize ) . theydidthisbyliterallyfusingmyelomacellswithantibody-secretingcellsfromanimmunizedmouse.thetechniqueiscalledsomatic tion.thetechniqueiscalledsomatic . ns-1是稳定的大鼠BALB/c癌细胞株，除了在培养基中可持续生长外，还具有重要的特性，细胞中有2种核酸代谢重

3、要酶TK，thymidinekk不足的hypo xanthine-guaninephosphoribosyltransferase， 普林斯， hatmediumbecauseitcontains : hypoxanthineaminopterinthepyrimidinethymidinethelogic : unfusedmyelomacellscannotgrowbecausete lspleencellscannotgrowindefinitelybecauseoftheirlimitedlifespan.hybridomacellsareabletogrowindefinition

4、thespleencellpartners partnerisimmortal.bcellmyelomafusion、HAT、ELISA、ELISA抗体生产：腹水中的抗体浓度非常高，每毫升可达数毫克。 2 )用大型培养槽培养融合细胞，收集培养液上清可得到抗体，但每mL只有数mg，浓度比腹水约薄千倍。 最近，有产生如腹水浓度上清的细胞培养瓶，但价格极高(ibsintegrabioscience : integracelline )。 3 )得到稳定的抗体后，通常用ELISA方法检测其抗体的subclass属于IgG、IgM、IgA等。 免疫时间太短，很可能得到IgM，但一般IgG多，注意IgG还

5、可以分为几个次子类。 4 )得到的抗体经提纯工序去除杂质，收集约40%饱和度的沉淀是最经济、最方便的方法。 离子交换法： DEAE阴离子交换法，多用于IgG的精制。 胶体过滤法：按分子量差异划分各种抗体，多用于IgM提纯。 亲和层分析法：用Protein A-吸附剂特异性吸附抗体分子(IgG )。 终点，终点， weraisedmonoclonalantibodiesagainstthekcsakchannelenlargecultureandselectedclonesonthebasisoftheirabilitytorecognizethetrame onomericformofthec

6、hannel .抗体的检测，1.ELISA用于对可溶性抗原(蛋白质)和细胞表面抗原的mAb的检测。 2 .用于检测2.FACS (流式细胞仪)细胞表面抗原的mAb。 用western blot检查单抗的特性。 杂交瘤细胞的克隆化、克隆化是指克隆抗体阳性孔。 这是因为HAT筛选的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。 在实际工作中，抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞等可能有几个以上的克隆。 必要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其他无关抗体分泌细胞。 为了将这些细胞相互分离，需要克隆化。克隆化的原则应尽早克隆检测抗体阳性的杂交克隆，抗体分泌的细胞被不能从抗体分泌的细胞所抑制。 抗体分泌的细胞生长速度比抗

7、体分泌的细胞快，两者竞争后，抗体分泌的细胞就会丢失。 克隆的杂交瘤细胞也需要定期再克隆，防止杂交瘤细胞突变和染色体丢失，丧失产生抗体的能力。 克隆方法很多，但最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。 单抗制造过程的影响因素a .污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。 b .融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的基础上，主要考虑以下因素，PEG可能有毒或作用时间过长。 牛血清质量差，使用前未进行严格筛选。 骨髓瘤细胞污染了支原体。 HAT有问题，主要是a含量过高或HT含量不足。 c .杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌的抗体：融合后有细胞生长，但无抗体产生，可引起HAT中的a失效和骨髓瘤细胞突变，形

8、成a抵抗细胞。 免疫原抗原性弱，可能免疫效果差。 杂交瘤细胞对原分泌抗体呈阴性，可能是支原体污染或非抗体分泌细胞的克隆竞争生长，而抑制抗体分泌细胞的生长。 染色体的丢失也有可能发生。 d .难以克隆杂交瘤细胞：由于犊牛血清质量、与杂交瘤细胞活性状态有关，或细胞有支原体污染，难以成功克隆。 如果是融合后的早期克隆化，应该在培养液中加入HT。 单克隆抗体的应用，(1)沉淀反应： Precipitation reaction (2)凝集实验： haemaglutination (3)放射免疫学方法免疫复合物，(4)流式细胞仪：用于细胞的分型，(5)ELISA等免疫学检测，(6) bias (7)免疫

9、印记(western blotting) (8)免疫沉淀： (9)亲和层分析：分离蛋白质(10 )磁珠分离细胞(11 )临床疾病的诊断和治疗。 人源化抗体、抗体药物、市场巨大、前景广阔。 目前单抗作为治疗用药的研究趋势，以应用领域：抗肿瘤、抗自身免疫、抗感染为主。 1 .寻找新的分子靶点2 .抗体的人类来源化、发展类型：人类来源化和全人类发展方向。 抗体药物应用中存在的问题：一般必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，得到的小鼠源性单抗必须来源于人，临床上能减少异源性蛋白引起的过敏反应，增加疗效。 鼠源抗体人源化后，抗体效应明显降低，临床治疗效应降低。 因为临床治疗需要大量的抗体(克级)，所以有必要用生物反

10、应器制造抗体。 由于抗体产量和质量有限，影响疗效。 遗传工程抗体的优缺点不受动物系(species )和抗体型(isotype )的限制。 利用嵌合抗体将小鼠源抗体人源化，减少潜在抗原表位，增强抗体的疗效。 全人源化抗体能够降低抗体的异源性和免疫源性，最大化高抗体的疗效。 缺点：抗体亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。 3 .偶联分子的细化4 .单抗药的效率化5 .双特异性抗体使宿主效应细胞活性化6 .使一部分氨基酸变化提高抗体的亲和性7 .抗体诱导的酶活性化前驱药技术。 目的：减少小鼠源性成分，降低HAMS反应(human易于大规模生产和临床应用)。 保持抗体的抗原结合能力。 基本

11、原理：against mouse syndrome )。 基因工程手段将编码Ab的重轻链可变区基因重组为真核表达载体进行表达。 另一方面，嵌合抗体，应用DNA重组技术，将小鼠抗体基因上的可变区域和人抗体基因的一定区域重组，将重组基因导入骨髓瘤细胞而表达.根据所用载体质粒标记的基因产物，选择合适的抗生素或制剂进行筛选，克隆采用与传统技术类似的方法分泌小鼠嵌合抗体的细胞株。 二、CDR移植的人源化抗体、小鼠源性抗体v区中的FR仍残留一定的免疫原性，该抗体还不是真正的人源化抗体，部分可产生较强的抗独特型反应。 为了减少小鼠来源的成分，人们再用FR代替小鼠FR形成更完整的人源化抗体，即除了三个CDR来

12、源于小鼠以外，其佝偻率均为人源化结构，即CDR移植抗体(CDR- grafted antibody ) 1 .人力资源改造抗体(1)嵌合抗体(2)人力资源化抗体(3)人力资源化抗体、基因工程抗体分类，3， 完全人源化1 .抗体文库技术噬菌体抗体文库技术的产生依赖于三种实验技术的发展，人们使用一组引物(免疫球蛋白可变区骨架部分的保守序列)，通过RT- PCR直接从b淋巴细胞总RNA中克隆免疫球蛋白可变区基因二是通过噬菌体展示技术(即筛选抗体与噬菌体外壳蛋白融合在噬菌体表面表达，采用亲和富集法表达特异活性的抗体)的建立，实现基因型与表型的统一，高效筛选三是表达大肠杆菌分泌结合功能的免疫球蛋白分子片

13、段。 噬菌体抗体库将基因型与表型整合在一起，结合选择能力与扩增能力，具有较强的筛选功能，体外模拟体内的抗体生成过程，抗体工程技术进入了新的时代。 噬菌体抗体库技术的发展使得在体外不经过免疫就获得抗体成为可能。 因为是在体外发生的，所以不依存于体内抗原的识别和提示系统，理论上可以制造出抵抗任何物质的抗体。 噬菌体抗体库技术目前也存在不足，例如免疫动物的抗体库获得的抗体亲和度不高，外源基因转化率有限，抗体库的库容量无法满足某些动物的抗体多样性等。 因此，大容量的抗体库是获得高亲和性抗体和稀有抗原抗体的关键。 2转基因小鼠技术是通过基因敲除技术使小鼠自身基因失活从而导入新基因，制作具有人的抗体重、轻

14、链基因簇且自身抗体基因失活的转基因小鼠。 这种抗人体小鼠(human antibody mouse，HuMab )所具有的人DNA片段具有完整的功能，能够有效地进行同种类型的转换和亲和力成熟。 转基因小鼠制备的人抗体的效果优于其他技术制备的抗正常人蛋白单抗。 小鼠识别抗原和动员抗原的抗体系仍然完整，易以人体蛋白识别为异物。 此外，由于抗体发生在体内，经过正常的组装和成熟过程，保证成品具有较高的靶向结合亲和力。 然而，转基因小鼠也有一些缺点。 也就是说，转基因通常有体细胞的突变和其他独特的序列，引起不完全的人序列，而且由于抗体嵌入小鼠体内，所以产生的单抗具有小鼠的糖基化模式，这些单抗最终并不是全

15、人类化的2、小分子抗体(1)Fab片段(2)单链抗体(scFv )、双链抗体、三链抗体(3)微抗体(minibody，两个scFv与抗体CH3区连接) (4)双特异性抗体(diabody) (5)其他形式的抗体(细胞内抗体、催化剂抗体、免疫脂霉缺点：小鼠的抗体部分也作为异种抗原，可多次使人体发生抗体和过敏反应(HAMS反应，human against mouse syndrome )。 嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原下降，但亲和力明显下降。 杂交瘤细胞株、两个可变区域酶切断、连接、克隆载体(t载体)、原核表达系统检查、或得到小鼠单抗轻链可变区域的基因片断。 2 .将含有人IgG重轻链一定区域的表达载体插入基因片断。 2、人源化抗体；和， humanizationorreshapingofmurineantibodiesisanattemptto