第二章 功能标记开发与定位.ppt

1、第二章功能性标记的发展和定位，第一节功能性标记的概念和类型，第二节功能性标记的发展和定位，第一节功能性标记的概念和类型，DNA标记多态性的分子基础示意图，分子标记在染色体上的分布，外显子、基因、代表标记、1.1功能标记的概念，也称为诊断标记，是基于基因内部序列的多态性位点开发的分子标记，其导致具有已知生物功能的表型变异。前提是目标基因的生物学功能已经确定。分子标记、性状、基因、重复序列、同源基因、已知功能、未知功能、连锁标记、功能标记、基因标记、1.2类功能标记、1.2.1 SRAP标记序列相关扩增多态性、扩增多态性相关序列。原理：通过独特的引物设计扩增开放阅读框，上游引物长度为17 bp以特

2、异性扩增外显子；下游引物长度为18 bp，可特异性扩增内含子区和启动子区。多态性是由不同的个体和不同的内含子、启动子和物种间隔长度造成的。内含子，外显子，外显子，内含子，正向引物，反向引物，1.2.2 SRAP标记程序，1引物设计上游引物长度17 bp，外显子特异性扩增；下游引物长度为18 bp，可特异性扩增内含子区和启动子区。2反应体系和条件，反应体系：20L 30 ng DNA模板，0.3mol/l引物，200mol/l dntps，1个聚合酶链反应缓冲液，1.5mol/l氯化镁，1 u Taq酶，不足部分用ddH2O补充。反应条件：94变性5分钟，1个循环；94变性1分钟，35复性1分钟

3、，72延伸1分钟，5个循环；94变性1分钟，50复性1分钟。72次延长1.5分钟，35次循环；72延伸5 min，3产物检测和图谱分析，4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，4个特征，共显性标记系统多态性强，DNA要求低，成本简单，标记分布均匀：如果不使用扩增区域序列信息，生成的标记是随机分布的，严格地说，它们不是功能性标记。如果SRAP引物是为特定基因设计的，它们就被标记为功能标记。1.2.3 TRAP标记、靶区扩增多态性、靶区扩增多态性或靶区扩增多态性。原理：利用生物信息学工具和科技英语数据库信息，我们可以生成目标候选基因区域的多态性标记。TRAP技术使用两个18核苷酸引物产生标记，一个是固定引物，

4、根据EST序列设计；另一种是随机引物，根据外显子和内含子的特点，设计成富含任意序列的GC或AT核心区。1引物设计，TRAP技术使用两个18核核苷酸引物产生标记，一个是固定引物，根据EST序列设计；另一种是随机引物，根据外显子和内含子的特点，设计成富含任意序列的GC或AT核心区。内含子、外显子、外显子、内含子、反向引物、正向引物、2个反应体系和条件、反应体系：20L 40 ng DNA模板、0.25 mol/L引物、200mol/L DNA TPS、1个聚合酶链反应缓冲液、15 mmol/L氯化镁、1 U Taq酶，不足部分用ddH2O补充。反应条件：94变性5分钟，1个循环；94变性1分钟，3

5、5复性1分钟，72延伸1分钟，5个循环；94变性1分钟，50复性1分钟。72次延长1.5分钟，35次循环；72延伸5 min，3产物检测和图谱分析，6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，1.2.4聚合酶链反应-DGGE标记，基于聚合酶链反应的变性梯度凝胶电泳标记。原理：根据功能基因域基序的单核苷酸多态性，设计引物进行特异性扩增，扩增产物经变性梯度凝胶电泳分析。聚合酶链反应程序，巢式或半巢式聚合酶链反应：TouchDowD94变性4分钟；退火20个周期(941分钟，65561分钟，721分钟，2个周期减少1)；10个周期(94.1分钟，55.1分钟，72.1分钟)；继续延长，72 6分钟。图谱分析，葡萄糖

6、262磷酸脱氢酶(G6PD)，急性白血病胸苷酸合酶(TS)，1.2.5其他功能标记，用于内含子扩增：IFLP:内含子片段长度多态性ISAP:内含子序列扩增多态性SSCP-单核苷酸多态性：基于单核苷酸多态性的单链核苷酸构象多态性用于启动子扩增：PRAP:启动子区扩增多态性用于外显子扩增：STS:序列标签位点RGA:抗病基因的相似序列，SSCP-单核苷酸多态性，SSCP-单核苷酸多态性，缺失区的插入，检测，微卫星区，检测，简单序列重复功能域标记(SSS GS3基因第二外显子的单核苷酸多态性(CA)功能标记与水稻粒长高度相关，GS3基因第二外显子单核苷酸从C突变为A导致水稻籽粒生长。 第二部分是功能

7、标记的发展。原理：引物是根据已知的功能基因序列变异区域设计的特异性扩增引物，扩增产物是独特的或易于与其他基因区分。在基因结构中，内含子区、5UTR、3UTR和外显子更保守。外显子、内含子、CDs(编码序列)、orf(开放阅读框)、STS功能标记开发，1获得某一已知功能基因序列，2比较同源序列或等位基因获得变异区序列，3设计变异区引物，4特异性扩增5分析图谱，搜索UniGene数据库(/UniGene/)寻找差异带，构建特定染色体基因组文库，随机选择克隆进行单个短片段测序， 通过比较确定没有重复序列，在序列上搜索引物，合成引物对基因组进行聚合酶

8、链反应，产物为单个片段，即硫-硫标记。 确认它在染色体上的位置。如：多酚氧化酶基因的STS功能标记的发展，2A染色体上多酚氧化酶基因的STS功能标记的分子基础，2A染色体上多酚氧化酶基因的STS功能标记的分子基础，2D染色体上多酚氧化酶基因的STS功能标记的分子基础。2D染色体上PPO基因的STS功能标记为713bp、490bp，PPO29和PPO16是一对互补标记，即PPO29扩增后，所有活性高的品种都能扩增490bp的条带，而活性低的品种不能扩增；PPO16扩增后，所有低活性品种均扩增出713bp条带，而高活性品种则没有。第3节，功能标记定位，3.1非整倍体定位技术，即使用功能标记的特异性引物扩增和分析相应非整倍体物种的基因组，如果哪条染色体或染色体臂没有扩增出靶带，则标记位于该染色体或染色体臂上。3.2连锁标记技术，即寻找与功能标记紧密连锁的分子标记，计算重组率，并在连锁图上定位功能标记。通常，使用的分子标记是SSR标记。3.3 FISH技术，即使用功能标记扩增的序列作为探针，用基因组染色体进行荧光原位杂交，具有杂交信号的染色体为定位染色体。3.4