DNA重组技术的基本工具.ppt

1、专题1 基因工程,题图： 科技探索之路： 1.1 DNA重组技术的基本工具 1.2 基因工程的基本操作程序 1.3 基因工程的应用 1.4 蛋白质工程的崛起,专题1 基因工程,从题图中可以看出： 1.沃森和克里克对 结构的重大发现和随后的技术创新孕育了基因工程。 2.在复制的DNA双螺旋结构上展示的转基因工程菌、牛、羊、鱼、番茄、甜椒、牵牛花等，代表了基因工程三个重要方面的研究成果：转基因 、转基因 和转基因 。,DNA双螺旋,微生物,动物,植物,综上所述，基因工程的主题：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生

2、物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，因此又叫做DNA重组技术。,DNA重组技术或基因拼接技术,生物体外,基因,DNA分子水平,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,基因重组,基因工程的概念,体外DNA重组和转基因等技术,阅读课本第2-3页“科技探索之路”基础技术和理论的发展催生了基因工程！,专题1 基因工程,从科技探索之路中可以看出： 说明没有 的研究成果，没有 的创新发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。,基础理论,技术,DNA的基本组成单位是：脱氧核苷酸,脱氧核苷酸 = 脱氧核糖 + 磷酸 + 含氮碱基,含氮碱基包括：A、T、G、C（四种碱基）

3、,磷酸,脱 氧 核 糖,碱基,鸟嘌呤脱氧核苷酸,胞嘧啶脱氧核苷酸,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,腺嘌呤脱氧核苷酸,脱氧核苷酸分子的连接：,磷酸二酯键,DNA分子是有 条链组成， 盘旋 成 结构。 交替连接，排列在外侧，构成基本骨架； 排列在内侧。 碱基通过 连接成碱基对，并遵循 原则。,反向平行,双螺旋,脱氧核糖和磷酸,碱基,氢键,碱基互补配对,2,DNA分子双螺旋结构模型,基因与DNA的关系？,基因是有遗传效应的DNA片段， 是生物体遗传的功能单位和结构单位。,转录,DNA,RNA,翻译,蛋白质,逆转录,中心法则和中心法则的发展,复制,复制,质 粒,质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外

4、，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,1.1 DNA重组技术的基本工具,转基因抗虫棉,抗虫棉,普通棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,重组DNA,导入,形成,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,形成重组DNA,关键步骤三：,重组DNA导入受体(棉花)细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,关键步骤一的工具：,关键步骤二的工具：,关键步骤三的工具：,分子手术刀限制性核酸限制酶,分

5、子缝合针DNA连接酶,分子运输车基因进入受体细胞的载体,自学导引：,阅读课本P4P7，完成学海导航的要点梳理。,大肠杆菌的一种coRI 限制酶能识别 序列，并在 之间切开。,限制酶,GAATTC,G和A,一.限制性核酸内切酶-“分子手术刀”：,限制性内切酶（EcoR）作用过程,限制酶,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,一.限制性核酸内切酶-“分子手术刀”： （1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。 （2）特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。（P4） （3）切割后的结果：产生黏性未端或平末端

6、（4）举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoR）能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,1.1 DNA重组技术的基本工具,限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。目前已发现的限制酶约4000种。,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,切割位点,和之间,和之间,未端类型,平末端,粘性末端,限制酶所识别的序列，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 图1-1 限制酶识别序列的中心轴线,思考:限制酶所识别的序列有什么

7、特点？,1.限制性核酸内切酶-“分子手术刀”： (1)来源： （2）特点： （3）切割后的形式：2种 分别为：黏性末端和平末端 注：限制性酶是一大类酶，不是一种酶。 限制酶大多可以专一性识别双链DNA分子上的某种特定核苷酸序列，限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称，重复排列的。,1.1 DNA重组技术的基本工具,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端

8、黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,例题：,1、下列关于限制酶的说法正确的是（ ） A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少 B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端 D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键,B,想一想: 这类酶在原核生物中起什么作用? 为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？,二、DNA连接酶“分子缝合针”,1.作用： 2.种类：（1）EcoliDNA连接酶 （2）T4DNA连接酶 3.实例2、见课本P5，图1-4，回答下列问题： （1）EcoR I是一种 酶，其识别序列是 ，切割位点是 与 之间的 键。切割

9、结果产生的DNA片段末端形式为 。 （2）不同来源DNA 片段结合，在这里需要的酶应是 连接酶，此酶的作用是在 与 之间形成 键而起“缝合”作用的。还有一种连接平末端的连接酶是 。,二. DNA连接酶“分子缝合针”,将双链末端之间的缝隙“缝合”起来,1.作用： 2.种类：（1）EcoliDNA连接酶 （2）T4DNA连接酶,DNA连接酶的作用过程,想一想:DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。,DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，在基因工程中起作用。,DNA聚合酶与DNA连接酶,

10、将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上,将DNA双链上的两个缺口同时连接起来,形成磷酸二酯键,以一条DNA链为模板,不需要模板,DNA连接酶和 DNA聚合酶的异同：,基因工程中所用的连接酶有两种：从大肠杆菌中分离得到的Ecoli连接酶、从T4噬菌体中分离得到的T4连接酶。这两种酶的催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。连接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成子链；而连接酶是将

11、DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此连接酶不需要模板。 两者都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.作用 2.条件 3.种类,1.作为载体没有切割位点将怎样？ 2.假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 3.目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？ 4.如果载体对受体细胞有害将怎样？,想一想:天然的DNA分子可以直接用作基因工程载体吗?,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.作用 2.条件 3.种类,1.考虑选用取自霍乱弧菌中的质粒来做载体. 2.用肉眼看不到载体是否真正进入，那么如何鉴定？ 3.没有一个或多个切割位点，能否进

12、行DNA的重组. 4.重组DNA不能复制，就可能怎样？,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因也 不含有抗氨苄青霉素基因,例题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论,三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.使用载体的目的：一是用它作为运载工具，将目

13、的基因转移到宿主细胞中；二是利用它在宿主细胞内进行大量的复制。 2.载体的种类：（1）质粒 （2）噬菌体的衍生物 （3）某些动植物病毒,3.作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,1）载体DNA 必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，才不至于因目的基因的插入而失活。 2）载体DNA 必须具备自我复制能力，或整合到受体染色体DNA 上，随染色体DNA 的复制而同步复制。 3）载体DNA必须有标记基因，以便重组后进行筛选。 4）载体DNA 必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受

14、体细胞外的其他生物细胞中去。 5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和体外操作。,模拟操作：重组DNA分子的模拟操作,注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。 首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对； 第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。,以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析： GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和 是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用DNA连接酶通常是 。 （2） 和 是由另一种限制酶切割形成

15、的 末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是 。,例题,本节内容小结：,1.知识梳理： DNA重组技术的基本工具： 限制酶（分子手术刀）：识别特定的核苷酸序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键； DNA连接酶（分子缝合针）：连接两核苷酸之间的磷酸二酯键； 基因进入受体细胞的载体（分子运输车）：最常用的是细菌质粒，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。,2.方法、技巧、规律总结：,限制酶切割的是磷酸二酯键，而DNA连接酶连接的正是两个断开此键的DNA片段。“分子运输车”是目的基因进入受体细胞的载体，它具有的若干特点是基因工程鉴定、选择、表达的关键，可以说，没有它，目的基因即使进入受体细胞，也难以稳定保存，更谈不上复制和表达。 3.思维误区提示： DNA连接酶与DNA聚合酶根本不是同类酶，其功能特点大不相同，注意其区别