《蛋白质组学修》PPT课件.ppt

1、,第九章 蛋白质组学 (Proteomics),第一节 概述 蛋白质组的概念及发展简史,20世纪生命科学的辉煌成就： 20世纪上半叶，以遗传学为代表， 以DNA双螺旋结构的提出而告捷； 20世纪下半叶，以分子生物学为代表， 以“中心法则”的问世而集大成； 20世纪90年代， “人类基因组计划（HGP） ”,基因与其编码产物蛋白的非线性关系,遗传信息从DNAmRNA结构蛋白质和功能蛋白质，构成一种有机体，完成生命的功能。 基因 mRNA蛋白质，三位一体，构成了遗传信息的流程图，这即是传统的中心法则。,基因组计划的局限 无法解决“基因精细调控”问题 大规模基因表达检测技术如：微阵列法、DNA芯片及

2、SAGE等，主要从mRNA水平来考虑。 而“mRNA”水平只反映了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质和蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。实际上无法反映蛋白质的质与量。,Protein production pathway,Human genomic sequences,mRNA,Protein product,Functional protein production,Transcriptioal control,Translational control,Post-translational control,mR

3、NA tells us what might happen,Proteome tells us what is happen,2020/7/29,基因组(genome) 转录组(transcriptome) 一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA. 蛋白质组(proteome) 一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组.,后基因组时代 功能基因组学成为研究重心 蛋白质组学是其“中流砥柱”，成为战略制高点,从基因组学到蛋白质组学,2020/7/29,人类基因组计划（HGP）：90年代，随着全球性基因组计划尤其是人类基因组计划（HGP）规模空前、速度惊人的推

4、进，基因研究已接近“登峰造极”，人类对生命的理性认识达到了前所未有的深度和广度。,2020/7/29,蛋白质组计划：基因组功能的阐明已经摆在面前，生命科学几乎在转瞬之间开始了新的征程蛋白质组计划，进入了一个新的纪元后基因组时代。,国际人类蛋白质组组织,以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。,基因是遗传信息的源头 功能性蛋白是基因功能的执行体,大规模、全方位的蛋白质研究势在必行,2020/7/29,蛋白质组学的提出及其意义,蛋白质组(proteome) ：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质。 蛋

5、白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译修饰、蛋白质功能确定、蛋白质与疾病的关系、蛋白质相互作用。,2020/7/29,蛋白质组的动态概念：不仅在同一机体的不同组织和不同细胞中不同，而且在同一机体的不同发育阶段、不同生理或环境下表现不同。,2020/7/29,2 意义,每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体在不同时间和空间出现，并发挥功能的不同组合的结果。基因 DNA的序列并不能提供这些信息，所以仅用核酸的语言不足以描述整个生命活动。 蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有重要的生物学意义和

6、医学应用价值，为阐明生命现象的本质奠定基础。,2020/7/29,由于基因剪接，蛋白质翻译后修饰和蛋白质剪接，基因遗传信息的表现规律就更加复杂，不再是经典的一个基因一个蛋白的对应关系。 一个基因可以表达的蛋白质数目可能很大。对细菌， 可能为 1.21.3；对酵母则为3；而对人，这个因子可高达10。,One Genome Many Proteomes,2020/7/29,2.1蛋白质鉴定： 可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。,第二节 蛋白质组学的研究内容,2020/7/29,2.3蛋白质与蛋白质的相互作用,对于阐

7、明细胞乃至整个生命活动的分子机制具有举足轻重的意义。细胞的任何活动都需要蛋白质分子与蛋白质分子、蛋白质与其他分子的相互作用，这也是调节细胞反应适度的必要条件。 如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。,2.4蛋白质的丰度变化,即各种蛋白质的识别和定量化，是对不同状态细胞的蛋白质差异表达进行比较，一般是指某种蛋白质在细胞内表达的相对含量的变化。,2020/7/29,2.5翻译后修饰 很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。 目前主要研究较多

8、的为蛋白质磷酸化，糖基化。,2.6 蛋白质分布,不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。,2020/7/29,2.7药物的靶分子的确定： 蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。 在基础医学和疾病机理研究中，这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。,蛋白质组学的难点,蛋白质组的多样性 蛋白质的种类确定 蛋白质组的动态性

9、 蛋白质组的时空性 蛋白质组学的技术,第三节 蛋白质组研究方法,蛋白质组研究的三大基本支撑技术 双向电泳技术（2DE） 计算机图像分析与大规模数据处理技术 质谱技术(MS),2020/7/29,蛋白质组研究方法,双向电泳技术：固定化pH梯度胶的出现，改善了双向电泳的重复性及上样量。 质谱技术：电喷雾质谱和基质辅助激光解析飞行时间质谱技术的发明及发展。 生物信息学的创立及其迅速发展：计算机图像分析与大规模数据处理技术,2020/7/29,3.1 蛋白质分离纯化技术,双向电泳技术 （two-dimension electrophoresis,2DE）,双向电泳 原理 在双向电泳中，第一向通常根据蛋

10、白质等电点的不同进行等电聚焦电泳（IEF），然后再根据分子量的不同进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）作为第二向。双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。,常用双向电泳设备,第一向等电聚焦电泳系统,第二向中等通量垂直电泳系统,样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE ） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） PDQuest等

11、软件分析（Software analysis）,双向电泳实验流程,等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）,根据不同蛋白质的等电点不同，将蛋白质加到含有不同pH值的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶中，蛋白质样品在此凝胶中移动到与其等电点相同的pH梯度处后净电荷为零，在凝胶中不再移动，也就是相同等电点的蛋白质聚焦在相同pH梯度处，从而把不同等电点的蛋白质分开。,2-D Electrophoresis,The 1st D: Isoelectric Focusing(IEF),IEF Theory,10 or 20 Fractions,Ampholytes generate pH

12、 gradient (pH 3-10),7.5,9.5,7.5,pI 4.5,7.5,7.5,7.5,pI 4.5,9.5,9.5,9.5,9.5,pI 4.5,3 4 5 6 7 8 9 10,Anode (+),Cathode (-),ACID,BASE,Proteins Migrate to their pI ( 0 net charge),IEF Theory,10 or 20 Fractions,Harvest with Vacuum Source,7.5,9.5,7.5,pI 4.5,7.5,7.5,7.5,pI 4.5,9.5,9.5,9.5,9.5,pI 4.5,3 4 5 6

13、 7 8 9 10,Anode (+),Cathode (-),ACID,BASE,The Rotofor System,A) Inject sample,B) Apply current,C) Focus proteins,D) Harvest fractions,双向电泳-第二向(SDS-PAGE),charge,size,The 2nd D: SDS-PAGE,Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size. Smallest proteins travel the furthest distan

14、ce,一、样品制备,样品制备基本原则,使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,样品制备（一）,细胞样品：反复冻融、超声破碎 组织样品：碾磨、匀浆 植物样品：碾磨 分泌蛋白 蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白 菌体蛋白 裂解液处理、超声破碎,双向电泳样品的溶解,是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合

15、的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须将可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。,增加样品溶解性的手段,离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。 去垢剂：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展

16、开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。,两性载体电解质： 即便在离液剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀 两性载体电解质的作用在于补充样品中少量的盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF的升压困难、速度降低。,样品中核酸的去除,对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决方法： 用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结

17、合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。 ReadyPrep 2-D cleanup kit,二、适用于质谱的染色方法,考马斯亮兰（Coomassie stain） 银染（Silver Stain ） 荧光染色（SYPRO Ruby protein gel stain）,考马斯亮蓝染色,考马斯亮蓝检测范围30-100ng，灵敏度较低，但染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。 胶体考马斯亮蓝染色的检测灵敏度为8-10ng，但染色时间较长（24-48小时），染色过程给下游质谱检测带来较多不便。 Bio-Safe染料是一种改良的胶体金染

18、色方法。安全无污染，染色非常快（2小时），完全与下游质谱兼容。,银染,银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。 快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。,荧光染料,SYPRO Ruby染料 灵敏度2-10ng，灵敏度与银染相仿，不对核酸染色 染色所需时间较短 染色的动态线性范围大大优于胶体金染色，扩展了约1000倍。 荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，不干扰质谱或免疫检测过程 Cy3和Cy5 两种染料可分别对两种蛋白质样品进行荧光标记，在一块2-D胶上同步运行，可以很方便的找出差异 但因其需要对蛋

19、白质进行共价修饰、改变了标记蛋白质的移动性能 由于荧光探针猝灭作用会引起快速衰减。蛋白与蛋白之间由于可被荧光团修饰的功能基团数目不同而使得灵敏度变化很大 荧光团的加入会降低蛋白质溶解性能。,负 染,能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。 结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。 速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。 它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。 该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。,pI,M.Wt.,100 g of E. coli p

20、rotein,综合的数据管理,PDQuest Image,Differential Analysis,Spot Cutting,Protein Digestion,Mass Spec PMF / MS-MS,Global Database Search / Protein ID,PDQuest Image Auto-annotation,激光捕获显微切割技术,激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，因此LCM技术实际上是一种原位技术。,Isolation of Subcellular Frac

21、tions,Isolation of mouse liver nuclear proteins,Cytoplasmic proteins,Nuclei proteins,pH 3-10 NL, 17 cm ReadyStrip IPG strips, 8 16% gel,激光捕获显微切割仪,LCM优点与不足,优点 (1)快速简单、高效直观、减少交叉污染； (2)制样灵活，使用范围广； (3)不但能有效保持分离样品结构的完整，而且不会破坏周围临近组织的完整。,不足,(1)用于显微切割的组织切片必须脱水干燥； (2)尽管LCM可以获得用于不同分子分析技术所需的几乎纯净的细胞，但捕获大量组织仍需要大

22、量时间。 (3)组织标本缺乏盖玻片与屈光介质，使得显微镜观察到的组织现象模糊。,3.2 蛋白质分析与鉴定技术,Edman降解法测N端序列 Edman降解法测序速度慢、费用偏高、灵敏度也不如快速发展的质谱,但它测定的肽序列非常准确，成为蛋白质鉴定的可靠依据。 通过C-末端和N-末端鉴定蛋白质是一种非常有效的手段，蛋白质中N-末端四个氨基酸特异性在43和83之间，而C-末端四个氨基酸特异性在74%和97%之间，更长的氨基酸则特异性更高。,3.2.1蛋白质氨基酸序列分析技术,3.2.2图谱分析技术（Image analysis）,图谱分析作为双向电泳的重要一步，其作用是评价和量化电泳结果。在蛋白质组

23、学研究中，需要用图像分析软件进行正常和异常，或发育不同阶段细胞、组织等电泳图谱间的匹配。,图谱处理分析典型流程,凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立：,蛋白质组研究的技术路线流程图,3.2.2生物质谱技术,生物质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异化来分离并确定分子质量。它具有高通量、灵敏、准确、自动化等特点，已逐步取代传统的Edman降解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白质鉴定的核心技术，已广泛应用于二维电泳、色谱分离的蛋白质，以及蛋白质复合体的鉴定。,2020/7/29,质谱技术的基本

24、原理是样品分子离子化后，根 据不同离子间的质荷比(/)在真空系中飞行速 度的差异来分离并确定其分子量。生物质谱仪通 常包含三个部分：离子源，质量分析器和检测器。 MALDI常用于分析蛋白质的酶切提取肽段混合物，进而获得肽质量指纹谱(PMF)，用MALDITOF仪器可以获得质量和精确度均佳的结果。,（1）基质辅助激光解吸附离子化质谱 （Matrix-assisted-laser-desorption-time-of-flight, MALDI-TOF/MS）,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪,（2）电喷雾电离串联质谱,电喷雾电离（ESI）利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，电喷雾

25、电离的特点是可生成高度带电的离子而不发生碎裂，这样可将质荷比（m/z）降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的范围，离子的真实分子质量可根据质荷比及电荷数算出。,电喷雾电离（ESI）原理,ESI过程图解,2020/7/29,将肽段注入质谱仪中，蛋白质沿氨基端被打碎为几个片段。这几个片段在第一个质谱中得到分离，然后，这些片段的质量在第二个质谱中得到测定。,串联质谱（tandam MS）,2020/7/29,所有获得的片段质量信息经过处理就形成该肽段的MSMS谱图，所获得的肽序列标签再在表达序列标签数据库中查找以鉴定该蛋白。 有些商品化仪器把反向液相色谱与MS相偶联，自动化LCMSMS，CEMSM

26、S仪器可以产生几百至几千个MSMS谱图，这样就有可能分析那些高度复杂复合物。,（3）与质谱（mass spectrometry）相关的技术,肽质量指纹图谱法（peptide mass fingerprint，PMF） 肽片段（peptide fragment）的部分测序 氨基酸组分分析 微量测序,肽质量指纹图谱法（peptide mass fingerprint，PMF）,未知蛋白胰酶切质量谱图及标准蛋白图谱,氨基酸组分分析系统,2020/7/29,大量数据库将支持基因组学及蛋白质组学的发展。 目前，主要数据库有蛋白质序列数据库（如SWISSPROT）、核酸序列数据库（如GenBank）、二维

27、凝胶数据库（如SWISS-2DPAGE）、翻译后修饰数据库（如-O-GLYCBASE）、代谢数据库等。,3.3 生物信息学(bioinformatics),2020/7/29,4.1表达蛋白质组学 该方法具有能够确定蛋白质量和检测到转录后修饰的优点。可以获得某种条件下的样品的蛋白质表达图谱，这样就能够进行比较蛋白质分析，从而在分子水平上阐明一些疾病发病机理，有利于疾病的诊断及治疗。 比较双向电泳表达图谱与相应的分化基因信息数据库的研究表明：mRNA及其相应蛋白质不一定存在相关性，如mRNA与其翻译的蛋白质并不是1 ：1的关系。,第四节 蛋白质组学研究前景,2020/7/29,人类4万个基因只有

28、不到1000个主要疾病的药物靶标，找到这些有用的靶标是一个很大的挑战。 通过与之相关连的蛋白质、细胞定位和在刺激物诱导下的变化情况来推断一种蛋白的功能。 通过对蛋白质复合物的纯化和质谱鉴定直接测定蛋白质蛋白质相互作用。这一方法已经被证实在发现新的信号分子复合物的组分过程中具有很重要的价值。,4.2 蛋白质蛋白质相互作用研究,蛋白质相互作用研究策略和方法,1.生化方法 蛋白质亲和层析 亲和印迹 免疫共沉淀 化学交联法 荧光共振能量转移法（FRET） 生物传感器技术（BIA） 2.分子生物学方法 酵母双杂法 噬菌体展示,2020/7/29,用亲和纯化、亚细胞分离及质谱鉴定可对蛋白质进行测序，再加以

29、基因标签的系统使用，能够得到许多蛋白质复合物及其各种蛋白质的细胞定位的图谱。 对不同细胞类型及在不同环境下的细胞蛋白质组进行分析，可以画出一个细胞的蛋白质的分布图谱，通过对细胞的蛋白质分布图谱的了解，有助于阐明生命活动规律及检测药物靶标的有效性，促进药物基因组学的发展。,4.3 细胞图谱蛋白质组学（cell-mapping proteomics）,总之：,蛋白质组学主要有两个研究策略： “竭泽法”：即采用高能量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。 “功能法”：即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。,蛋白质

30、组学的应用与发展趋势,随着整合样品处理、分级分离、质谱鉴定以及数据分析软件平台为一体的蛋白组学研究系统的不断推陈出新，以及适于大规模蛋白质组学数据分析的生物信息学平台的建立，蛋白组学己经成为生命科学研究中的重要支撑技术。 蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（system biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。,蛋白质组学的应用,在应用研究方面，蛋白质组学研究显示出广泛的应用前景。蛋白质组学研究特别是定量蛋白质组学研究，标志着蛋白质组学研究正由定性向准确的定量方向发展。它将为人们更加完整地揭示生长、发育和代谢调控等生命活动

31、的规律和严重疾病的发生机理，为人类进行疾病的诊断、防治和新药开发提供重要的理论基础。,在原核及简单真核生物的蛋白质组研究方面,流感嗜血杆菌的蛋白质组学研究 (Haemophilus influenzae) 大肠杆菌的蛋白质组学研究 致病微生物的蛋白质组学研究 酿酒酵母的蛋白质组学研究,在多细胞真核生物的蛋白质组研究方面,线虫的蛋白质组学研究 果蝇的蛋白质组学研究 人类的蛋白质组学研究 植物的蛋白质组学研究,蛋白质组学研究现状和发展趋势,蛋白质组学已成为重要的前沿领域之一。各个国家和地区都已将蛋白质组学作为优先支持发展的领域，相继启动各具特色的大型蛋白质组学研究计划，大力推动本国蛋白质组学的发展

32、，力图在这场新世纪最激烈的生命科学竞争中取得先机，抢占一席之地。,6.2.1蛋白质组学研究现状,国外研究现状： 美国NCI肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋白质组数据库 NCI与FDA有关癌症不同发病阶段和治疗阶段的蛋白质组数据库 欧共体酵母蛋白质组研究 英国、法国、德国、澳大利亚、日本等国也分别投入巨资进行蛋白质组学的研究 此外，Celera公司、日内瓦蛋白质组公司与布鲁克质谱仪制造公司,国内研究现状： 国家自然科学基金委于1997年设立了重大项目“蛋白质组学技术体系的建立” 中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院与湖南师范大学已启动蛋白质组研究 中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质组学研究中心,国内研究现状： 在“重大疾病的功能蛋白质组学”方面取得了良好的起步 已进行肝癌细胞系及正常肝细胞蛋白质组的比较分析研究，发现了两者间不同的蛋白表达群 进行了我国自行建立的肝癌高/低转移细胞系、肺癌高/低转移细胞系、原位食管癌/转移食管癌间的比较蛋白质组研究，初步发现一批与肿瘤转移相关的蛋白质群 对心肌细胞与应激损伤的心肌细胞的比较蛋白质组研究也有了一定的基础,我国“蛋白质组研究计划”应关注的重点基础科学问题,一是“人类基因组”、“水稻基因组”等的系统注解、破译，