实验三双缩脲法蛋白质含量测定.ppt

1、蛋白质含量的测定，缩二脲法方法，实验目的，学习分光光度法测定的原理和方法，掌握用缩二脲法测定蛋白质含量的方法和实验原理，缩二脲(NH3CONHCONH3)是将两分子尿素在180左右加热，释放出一分子氨的产物。在强碱溶液中，缩二脲与硫酸铜形成紫色络合物，称为缩二脲试验。所有具有两个酰胺基或两个直接相连的肽键，或可通过中间碳原子相连的肽键的化合物都有缩二脲试验。紫色络合物的颜色与蛋白质浓度成正比，但与蛋白质分子量和氨基酸组成无关，因此可用于测定蛋白质含量。测量范围为1-10毫克蛋白质。主要干扰物质是Tris缓冲液和一些氨基酸。这种方法的优点是速度更快，不同的蛋白质有相似的颜色，而且干扰物质很少。主

2、要缺点是灵敏度差。因此，缩二脲法常用于蛋白质测定，它需要快速，但不需要非常精确。蛋白质测定方法：缩二脲法(biulet法)、凯氏定氮法、福林酚试剂法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法、BCA总蛋白定量分析法、实验试剂和设备(1)、实验试剂1、标准蛋白质溶液：用标准结晶牛血清白蛋白(BSA)或标准酪蛋白制备10毫克/毫升标准蛋白质溶液。2.缩二脲试剂；(2)实验设备：可见分光光度计。分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下具有吸收光的作用，物质对光的吸收是选择性的。不同的物质有各自的吸收光谱，所以当单色光通过溶液时，其能量会被吸收并减弱，而光能减弱的程度与物质的浓度有一定的正比关系，即它符合朗伯-

3、比尔斯定律：的比色原理，数学表达式： A=lg(1/T)=KCL A是吸光度T是透射率，投射光强度高于入射光强度C，即吸光物质的浓度L、吸收层的厚度K和吸收系数。其物理意义是，当平行单色光垂直穿过均匀无散射的西方光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度C和吸收层的厚度L成正比。仪器操作键介绍“模式设定”键：用于设定测试模式“100%T/0AB”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0AB(零吸光度)“0% T”键：用于自动调整零透射比“波长设定”旋钮：用于设定分析波长，将仪器样品预热20分钟，使用“波长设定”按钮将波长设定在您将要使用的分析波长位置，打开样品室盖，将阻光器插入比色皿架，

4、 将其推入或拉入光路，盖上样品室盖，按下“0%T”键将透射率调至零，取出遮光器，盖上样品室盖。 按“100%测试”调整100%透光率，按“模式”将测试模式设置为吸光度模式。(a)将参比溶液和待测溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将装有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖，将参比溶液推入或拉出光路，按下“100%测试”调整零点，每次测量前使用注：检查，检查波长是否为要求值；比色皿应具有磨砂表面，透明表面不应用手触摸；比色杯装样品前，用样品清洗两次，样品体积为比色杯体积的2/3；向试管中添加样品时，如果样品流到试管外壁，应使用滤纸干燥，不要用滤纸擦拭。试管容易被划伤；测量后，用蒸馏水清洗比色皿并将其放好。操作方法：1 .测量标准曲线。将12支试管分成两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0毫升标准蛋白溶液，加水补足至1毫升，然后加入4毫升缩二脲试剂。摇匀后，在室温(2025)下放置20分钟，在540纳米处进行比色测定(测定必须在30分钟内完成)。使用第一个不含蛋白质溶液的试管作为空白对照溶液。取两组的测量平均值，以蛋白质含量为水平坐标，吸光值为垂直坐标绘制标准曲线。2.样品测定取2-3个试管，用与上述相同的方法测定未知样品