免疫浊度技术概述.ppt

1、实验免疫浊度技术,免疫反应进展,1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应 抗血清混合出现沉淀 1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于 其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行 1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术 1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性 免疫试验向定量化发展 1966年 免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微 量、自动化的新阶段。,实验免疫浊度技术,免疫测定原理 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 抗原 + 抗体 抗原抗体复合物 Ag + Ab Ag * Ab,实验免疫浊度技术,免疫测定特点 特异性 抗原性不同的物质不干扰

2、 敏感性 g-ng-pg 可测物 蛋白质，酶，激素，药物 ， 毒品,实验免疫浊度技术,免疫检测的基础抗原抗体间的特异性反应 手工操作 自动化分析 免疫比浊分析技术发展,实验免疫浊度技术,两 个 阶 段,测定抗原抗体形成后的阶段 散射(终点)比浊,测定抗原抗体结合的峰值 速率散射比浊,免疫比浊法分类,当一束光 线通过溶 液受到光 散射和光 吸收两个 因素的影 响而使光 的强度减 弱,透射比浊法: 在光源的光路方向（00） 测量透射光强度和被检测 溶液微粒浓度关系的方法。,散射比浊法: 在光源的光路方向（50-960） 角的方向上测量散射光强度 和被检测溶液中微粒浓度关 系的方法。,实验免疫浊度技

3、术,透射比浊 / 散射比浊,光源,滤光片,反应杯,透射光检测,散射光检测,实验免疫浊度技术,一、散射免疫比浊分析原理 散射比浊法：在液相中可溶性抗原、抗体特异性结合，形成一定大小的复合物粒子，当入射光沿水平轴照射在粒子颗粒上时，光线被颗粒吸收或折射，发生偏转，其偏 转的角度与发射光的波 长和复合物颗粒大小和 多少有关。散射光的强 度与复合物的含量成正 比，即待测抗原越多， 形成的复合物越多，散 射光就越强。,影响散射信号的因素： 如入射光的波长、偏振、 微粒大小、浓度、质量、 以及检测点的距离。,实验免疫浊度技术,（一）散射颗粒与散射光 Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量呈正比，

4、与散射 光的夹角呈正比，与波长呈反比。 在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积，减少入射光的波 长，扩大散射光夹角等因素，均可增加检测的敏感度。,如果颗粒直径比入射光的波长小的多 则散射光的分布比较均匀 如果颗粒直径接近入射光的波长， 则散射光的分布呈明显不均匀,称为Rayleigh散射,称为 Mile散射,实验免疫浊度技术,（二）反应物含量与散射浊度,Heidelberger曲线： 即当抗体量恒定时，形成的抗原抗体复合物的反应与散射 信号响应值的上升呈正比。同时，散射信号随抗原抗体 反应时间增加而曲线上升。,当抗原量与响应值上升到一极限时，再增加抗原量， 使散射响应值迅速下降,因此，在采用

5、散射比浊测定时，一定要保证抗体过量。,实验免疫浊度技术,二、定时散射比浊分析 （一）基本原理,是将沉淀反应与散射比浊分析相结合，“在抗原抗体反 应几秒钟后开始测定峰值信号”。 目的是排除抗原抗体反应的不稳定性，降低检测误差。 采用抗体过量，以获得颗粒产生的最强的散射光信号。,时间 检测分两个,在预反应时段， 加小量样本与 抗原抗体反应， 测定第一次散 射光信号值,加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号,信号峰值 计算机处理 转换为样 品浓度,实验免疫浊度技术,二、定时散射比浊分析 （二）抗原过量检测,抗体过量 在检测中抗体结合抗原的能力可达到相当于正常 血清的50倍以上，以保证高浓

6、度样本中的抗原与 抗体的结合。 对抗原过量进行阈值限定 先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超 过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。,采用两项保证措施：,实验免疫浊度技术,三、速率散射比浊分析 （一）基本原理, 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。 所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。 当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时， 即出现速率峰，该峰 值的高低，即代表所 测抗原的量。,实验免疫浊度技术,三、速率散射比浊分析 （一）基本原理 （二

7、）抗原过量检测 设计原理 , 速率峰值一般在25秒时出现。 在反应介质中加入一定量的促凝剂，可加速抗 原抗体复合物的形成，以减少反应时间。 速率法的优点：是快 速、不需要减去样本 和试剂本底读数，校 正结果也较稳定。,实验免疫浊度技术,四、免疫透射比浊分析 （一）基本原理,当光源的光路（角度与正前方夹角为00时），通 过一定体积的溶液，由于溶液中抗原抗体结合复 合物粒子对入射光因反射、吸收或散射而衰减。 透射光的强度和形成的复合物的量呈反比。,检测器,检测器,光源 透镜 滤光片,平光线,散,射,光,透射光,散射比浊、透射比浊光路图,实验免疫浊度技术,四、免疫透射比浊分析 （一）基本原理 是个极

8、其简单的方法。在抗原过量情况下，与待测样品中相应的Ig发生抗原-抗体反应，形成可溶性复合物，使反应介质的浊度发生改变。 测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以吸收单位（A）或OD值表示，A值反映了入射光和透射光的比率。待测物中Ig含量可通过标准曲线计算得出。 待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射光呈反比。 反应在PEG的作用下，加速复合物的形成。,实验免疫浊度技术,四、免疫透射比浊分析 （二）实验要求,溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm) 溶液中形成的复合物分子要足够多 控制抗原抗体反应的温度和时间 加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 应选择亲和力好、效价高

9、的抗体，保证抗体过量 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A) 为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标 准曲线，,实验免疫浊度技术,免疫比浊分析的临床应用,检 范 围 测,如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM 、；补体C3、C4； 血浆蛋白AAT、TRF、A1M、 CER； 尿蛋白系列尿微量白蛋白 视黄醇结合蛋白 转铁蛋白 2 微球蛋白(2M) 1微球蛋白(1M) 小分子治疗药物,检 范 围 测,血浆、体液中特种蛋白,实验免疫浊度技术,欢迎来到 速率散射王国,IMMAGE Immunochemistry System,IMMAGE 双光径速率浊度分析系统,高效蛋白分析仪 随机TDM分析

10、仪,两种技术(透射法+散射法)，四种方法 速率散射比浊法 ( 蛋白检测) 速率抑制散射比浊法 ( TDM) 近红外颗粒速率法免疫分析(Rate NIPIA) 速率抑制NIPIA ( 低分子量TDM),IMMAGE检测原理- 速率散射法(670nm) ARRAY的优秀传统： 20年实践证明卓越的精确度和准确度,激光光源,近红外颗粒透射免疫分析法： 速率透射法(940nm) 增加高敏分析检测菜单： 地高辛，H-CRP，铁蛋白 排除高胆红素和溶血性样本的非特异性干扰,LED光源,速率散射抑制法(670nm) TDM检测,On board cooling system,试剂冷藏系统-增加试剂稳定性 四

11、个缓冲液位-完成1400个测试 样品针试剂针分离- 同时完成取样和加试剂 提高检测速度 全面的液面探测系统 Level Sensor Fluid Sensor,IMMAGE,39个半永久性反应杯- 同时检测质控、定标和样本 全面的条形码系统(各种通用条形码) 72个样本位 (每试剂位检测24种项目),真正的随机急诊 功能(不需停机),IMMAGE,-自动校正光源 - 原始试管功能,- 灵活的系统界面：触摸式，鼠标，键盘 - 24小时随时待机 - 每日保养：擦拭探针 - 特殊的试剂盖: 不再需要开关瓶(穿刺式),IMMAGE,简便的操作系统,单点定标,IMMAGE,在速率峰基础上完成的定标曲线,Concentration,Rate,单点定标,IMMAGE,减少定标次数 提高检测速度 节省试剂用量,NCC