牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞增殖的双向调节作用

1、牛大力多糖对小鼠淋巴细胞增殖的双向调节作用摘要目的：提取纯化鸡血藤多糖。用流式细胞仪检测多糖对刀豆球蛋白A(ConA)刺激小鼠T淋巴细胞增殖的影响，探讨多糖对免疫系统的调节机制，为牛大力临床治疗各种慢性疾病提供理论和实验依据。方法：从牛大力中提取纯化多糖，用CFDA染色和流式细胞仪检测多糖对柯纳诱导的淋巴细胞增殖的影响。结果：160g/mL、800g/mL、4mg/mL和20mg/mL的终浓度对小鼠T淋巴细胞增殖有剂量依赖性抑制作用，而5、25、50和125g/mL的终浓度对小鼠T淋巴细胞增殖有剂量依赖性促进作用。结论：牛大力多糖能双向调节小鼠淋巴细胞的增殖。关键词牛大力；多糖；t淋巴细胞。C

2、FDA东南MillettiaSpeciosaChamp。又名山藕和大理马铃薯，是鸡血藤的干燥根。属豆科，主要产于粤东。牛大力的药最早使用于生草药性备要 2，历史悠久，味甘平，具有补虚润肺、强筋活络的功效。主要用于治疗肺热咳嗽、类风湿性关节炎、腰肌劳损、胃溃疡、慢性肝炎、肺结核等疾病1。早在20世纪70年代，牛大力作为壮腰沈剑丸和李强健身胶囊的原料，就已经用于中成药的生产3。目前，已有关于大鲵的免疫活性的报道4，但其多糖的药理活性未见报道。本文从牛大力中提取、分离、纯化多糖，鉴定其主要理化性质，并通过ConA硒染色和流式细胞术研究多糖对刀豆球蛋白A(ConA)诱导的T淋巴细胞增殖的影响，为阐明其

3、对免疫系统的作用和临床治疗各种疾病提供理论和实验依据，为牛大力的进一步开发利用提供科学依据。1种材料1.1动物雄性SPF Balb/c小鼠，4 5周龄，体重(122)g，由中山大学动物研究所提供(合格证号00A005)。1.2试剂和仪器牛大力购自广州天河石牌东白康源药店，经鉴定为鸡血藤的根。vy-branttmfda-secelltracerkit(c-1288)是从美国MolecularProbes公司购买的。ConA、RPMI-1640、胎牛血清、谷氨酰胺和-二巯基乙醇都是从西格玛公司购买的。流式细胞仪，美国贝克顿迪金森公司的产品；旋转蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂。2方法和结果2.1牛大力

4、多糖理化性质的测定2.1.1牛大力多糖的提取和纯化称取鲜干牛大力片800克，粉碎，用6倍量的水在90下煮沸1小时，过滤，加入5倍量的水，煮沸1小时，过滤，再次重复，合并3次滤液，旋转蒸发浓缩，向浓缩液中加入无水乙醇，使溶液中乙醇浓度达到80%，沉淀出大量白色絮状沉淀，并在4 8放置过夜，然后过滤。用适量水溶解，加入总体积为25%的Sevage试剂(氯仿戊醇=51)，摇匀成胶状，离心除去沉淀和乳化层中的蛋白质，重复上述操作两次除去蛋白质。将上清液浓缩，放入分子量为8000-10000的透析袋中，在流动蒸馏水中透析过夜，取出透析袋中的溶液，浓缩后加入无水乙醇至乙醇浓度达到80%，在4 8放置过夜，

5、然后过滤。沉淀物依次用丙酮和甲醇洗涤脱色，在50下干燥，得到牛大力多糖5。2.1.2多糖含量测定根据文献6，7，用蒽酮-硫酸法测定粗产品中的糖含量，并与标准曲线进行比较，得到线性回归方程y=0.0047x-0.0003通过活髓切断术杀死Balb/c小鼠，无菌取小鼠的颈部、腋窝、腹股沟和肠系膜的淋巴结，取出胶囊，收集细胞并用PBS (180g，10分钟)离心两次，并用PBS重悬。2.2.2淋巴细胞CFDA-硒染色CFDA-硒溶于含二甲基亚砜的10毫升/升贮存溶液中，贮存于-20。使用前，用1摩尔/升的工作溶液稀释适量的硒化镉，平衡至室温，备用。将淋巴细胞悬液的密度调至107个细胞/毫升，将细胞悬

6、液按100001的体积比加入CFDA-硒工作液中，室温下避光混匀10分钟，然后用RPMI-1640全培养液(含10个细胞，180克，10分钟)洗涤细胞两次，将细胞浓度调至2106个细胞。2.2.3多糖对小鼠t淋巴细胞增殖的影响将CFDA-硒标记的淋巴细胞接种到96孔细胞培养板上，分别设空白对照组、ConA组和ConA多糖溶液实验组。实验组多糖的最终浓度分别为5、25、50、125、160、800g/mL、4、20g/mL，体积固定为200L/孔。上述实验组的ConA浓度为5微克/毫升。在5% CO2培养箱中于37孵育48小时后检测CFSE荧光强度(FL1)。2.2.4流式细胞仪检测、分析和数据

7、统计羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-硒)是一种染色细胞结构蛋白的荧光染料。本文中，CFDA-SE标记技术是利用CFDA-SE随着细胞每一代增殖，荧光强度减半的系列，结合流式细胞术，动态跟踪分析细胞增殖技术，计算增殖指数(pi)，即增殖后细胞总数与增殖前细胞总数的比值)，并研究t细胞的增殖8，9。从流式细胞仪和CELLQuest软件获取数据。淋巴细胞区在FSC和SSC的二维散点图中画出，并分别检测各组该组细胞的FL1强度。在每个试管样本中检测到10000个细胞，并通过CELLQuest软件分析获得的数据。统计方法是t检验，数据用平均标准偏差(xs)表示。培养48小时后，通过流式细胞术检测空白对照组

8、，结果显示大多数细胞处于亲本峰，分别为1.01和1.00，表明T淋巴细胞不增殖(见图2A和3A)。在ConA组中，除了母峰外，T淋巴细胞也出现子峰(见图2B和3B)，这表明在ConA刺激48小时后，T淋巴细胞显著增殖。与对照组相比，子代细胞的荧光强度减半。处理48小时后，浓度为5、25、50和125g/mL的多糖均可促进ConA刺激的小鼠T淋巴细胞增殖。这些实验组的PI值高于相应的ConA刺激组，但没有剂量依赖关系(见图2c 2f)。然而，浓度为160g/mL、800g/mL、4mg/mL和20mg/mL的实验组均抑制了ConA刺激诱导的小鼠T淋巴细胞增殖，且其PI值明显低于ConA刺激组，且

9、呈剂量依赖性抑制(见图3c 3f)。其中，最终浓度为160g/mL、800g/mL和4mg/mL的实验组出现母峰、第一代峰和第二代峰(见图3c 3e)。20毫克/毫升的最终浓度仅显示一个亲本峰和一个弱子代峰，其值为1.03，这几乎完全抑制了由ConA刺激的小鼠t淋巴细胞的增殖(见图3F)。综上所述，在最终浓度为5、25、50和125g/mL时，牛大力多糖能促进小鼠T淋巴细胞的增殖，但其量效关系不明显。在最终浓度为160g/mL、800g/mL、4mg/mL和20mg/mL时，能抑制小鼠T淋巴细胞的增殖，且呈剂量依赖性。3讨论本实验用ConA刺激T细胞增殖，牛大力多糖对ConA刺激诱导的T细胞增

10、殖的抑制或促进作用可以通过CFSE荧光强度的变化来表现。增殖指数通过CELLQuest软件拟合得到，并对多糖的影响进行可视化、量化和量化本研究发现牛大力多糖是调节免疫功能的主要活性成分之一。牛大力多糖对小鼠T淋巴细胞增殖具有双向调节作用。T细胞是整个免疫反应中的关键细胞之一，干预T淋巴细胞的行为可以有效调节机体的免疫反应。这为探讨牛大力的抗炎和免疫增强作用提供了线索。认为炎症如肝炎与淋巴细胞活化和增殖直接或间接相关。慢性肝炎的发病机制与辅助性T细胞的免疫功能密切相关。由于牛大力高浓度多糖能抑制T淋巴细胞增殖，且具有明显的剂量依赖性。牛大力可能通过多糖抑制T淋巴细胞的增殖，从而抑制Th细胞的功能，调节细胞免疫。这可能是牛能有效治疗这些疾病的原因之一。在已报道的牛大力治疗慢性肝炎的中药方剂中，牛大力用量最大1。牛大力处方的高剂量可以形成更高浓度的多糖溶液。此外，牛大力具有补虚润肺、强筋活络、强身健体、增强机体免疫力和抗病能力的作用8，而低浓度的牛大力多糖能促进T淋巴细胞的增殖。因此，推测牛大力可能通过多糖促进T淋巴细胞增殖，从而增强机体免疫力。然而，本实验发现牛大力低浓度多糖对T细胞没有明显的剂量依赖性作用。本研究为调节免疫反应、抑制炎症、增强免疫力等