登革热实验室检测指南

1、附件2登革热实验室检测指南一.目的(a)及时发现和诊断病例。(二)及时了解伊蚊携带的登革热病毒。(3)病毒分类和可追溯性。(4)为登革热流行趋势预测和预警以及制定防控措施提供科学依据。二、检测对象(1)疑似和临床诊断病例(根据登革热诊断标准ws216-2008)。(2)成蚊和伊蚊幼虫。iii .样品收集、保存和运输(a)临床标本收集用无菌真空干燥管收集患者的非抗凝血液，及时分离血清，一式两份，用带螺帽和垫圈的冷冻保存管保存，并在低温条件下保存，标记清楚后，一份用于现场实验室试验，另一份用于上级防控机构的审查(附件1，附表1)。1.对于临床诊断病例和疑似登革热病例，每次应采集5ml血样。2.对于

2、登革热的临床诊断和疑似住院病例(包括初始筛查阴性)，应采集两份血样，入院前每天一份，出院前每天一份。3.对于第一例疫点，必要时应采集第二份血样，从采集第一份血样之日起的间隔时间应大于7天。(2)蚊媒标本的采集对疫区采集的成蚊和埃及伊蚊幼虫进行分类鉴定，然后根据采集地点分别填写采集媒介标本信息表并包装，每管10-20只。(3)标本的保存和运输样品应保持在-70以下，血液样品可保持在-20以下，但不超过1周。标本应低温冷藏运输，避免冻融，样品运输应符合国家相关生物安全规定。四、测试内容(a)实验室测试发生登革热疑似病例的医院和/或县(市)疾病控制机构收集病例血清，以检测登革热病毒抗原、核酸或抗体。

3、检测过程见图1。(2)检查和测试1.送市级或省级疾病预防控制机构临床标本，并抽取30%进行复检。应通过病原学和/或双标本血清学方法重新检查第一批疫点病例。至少有5例病例应重新检查是否有暴发。所有少于5例的病例都应进行检测，病毒核酸阳性标本应进行分型检测。2.对初发病例、重症病例和输入性病例急性期标本进行聚合酶链反应分型，阳性病例应分离出病毒，并从临床标本或分离出的病毒中扩增出e蛋白编码基因，完成序列分析。3.每次爆发都要分析病毒的全基因组序列。4.对于实验室检测的阴性临床病例和重症病例，应在恢复期检测血清中的igm、igg抗体和/或中和抗体。(3)培养基标本的检测1.核酸检测对捕获的成蚊或伊蚊

4、幼虫进行核酸分型检测，扩增病毒e蛋白编码基因，完成序列分析。2.病毒分离法病毒核酸阳性标本由国家、省或有条件的市级疾病预防控制机构分离和分析。图1疑似登革热病例的实验室检测过程五、实验室检测方法(a)临床标本检验1.病原检测病原检测主要适用于急性血样。(1)抗原检测：一般来说，发病后6天内血样中ns1抗原的检出率较高。标本中ns1抗原的检测可确认病毒感染，适用于现场快速检测和早期诊断(附录2和3)。(2)核酸检测：一般来说，血液样本中病毒核酸的检出率在发病后6天内较高。对患者血清中病毒核酸的检测可以进行确认和分类，可用于早期诊断。然而，核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此需要严格的分区操作(附

5、件4)。(3)病毒分离：一般来说，发病后5天内血样的病毒分离率较高。将样品接种到蚊子来源的细胞(c6/36)或哺乳动物中(1)血清特异性igm抗体：采用酶联免疫吸附试验和免疫层析法检测。igm抗体呈阳性，提示患者可能是新感染登革热病毒，这适用于登革热的早期诊断，但单一标本无法确诊(附件6)。(2)血清特异性抗体：采用酶联免疫吸附法、ifa法和免疫层析法进行检测。可确认恢复期血清igg抗体转正或igg抗体效价比急性期增加4倍以上(附件7和8)。(3)中和抗体：可用于菌斑减少中和试验和微量中和试验的分型。可证实恢复期血清中和抗体阳性或效价比急性期高4倍以上。(2)培养基标本的检测1.样本处理分类后

6、，每10 20只成蚊或埃及伊蚊幼虫将根据采集地点进行研磨(附件9)。2.病毒核酸检测通过逆转录聚合酶链反应检测登革病毒核酸(见附件4)。3.病毒分离法分离病毒核酸阳性标本(见附件5)。六.实验室质量控制(a)标本收集、保存和运输采集的标本应做好标记，记录标本的基本信息和流行病学信息，并按本指南的要求进行采集、保存和运输。(2)实验室测试1.根据发病时间，根据本指南的要求选择不同的检测方法。2.核酸检测应防止各种污染，并应根据操作规范设置相应的控制。3.应对检测试剂进行质量控制评估。(三)各级疾病预防控制机构应定期开展监督检查、实验室技术人员培训和考核，并及时发现问题。七、结果报告和反馈疫区第一

7、例、重症和输入性病例的实验室检测结果应在24小时内反馈给标本检验单位。省级疾病预防控制机构应于每年1月向国家疾病预防控制中心报告上一年度登革热实验室病原学(包括核酸检测、病毒分离和序列测定)监测结果(见表2)，并将结果发送至。八.生物研究安全性登革热的实验室检测应符合病原微生物实验室生物安全管理条例等相关法规的要求，并做好生物安全工作。附件：1.血液标本采集、血清分离、运输和保存的标准化操作程序2.用酶联免疫吸附试验检测登革病毒ns1抗原的标准操作程序3.用免疫层析法检测登革病毒ns1抗原的标准操作程序4.用逆转录聚合酶链反应对登革病毒核酸进行分型和检测的标准

8、操作程序5.通过细胞培养分离登革病毒6.用抗体捕获酶联免疫吸附试验检测登革热抗体7.用酶联免疫吸附试验检测登革病毒抗体的标准操作程序8.通过免疫荧光检测登革病毒igg抗体的标准操作程序9.蚊媒标本处理的标准操作程序附表：1.为疑似登革热患者提交的样本清单2.病原检测结果列表附件1血液标本采集、血清分离、运输和保存的标准化操作程序1目的正确采集血样、分离血清、运输和保存。2范围适用于合格人员采集血样、分离血清、编号、包装、储存和运输登革热患者或疑似患者。3个操作步骤3.1采血3.1.1用70%酒精擦拭静脉穿刺部位30秒以上。3.1.2然后用碘酊或碘伏棉签(1-2%碘酊30秒或10%碘伏60秒)对

9、皮肤进行消毒，从穿刺点向外画一个直径为1.5-2厘米的圆圈进行消毒。3.1.3用70%酒精脱碘。3.1.4严格执行三步消毒后(注意对碘过敏的患者，只能用70%酒精消毒60秒)，在穿刺部位酒精蒸发干燥后，从患者体内收集5ml非抗凝血液。3.2血清分离3.2.1轻轻翻转采血管几次，将血液与凝结剂混合，然后让其静置，直到血凝块i3.2.3标记。用标签纸或永久性记号笔在冷冻保存管的侧壁上标记标本编号，并在顶端标记序列号。标记清晰后，将血清放入标本盒中，保存在2-8的冰箱中进行初步筛选或运输。编码规则为“jh年份(2位数字)、月份(2位数字)和序列号(3位数字)”。例如，2013年8月在景洪市采集的第1

10、2份血样的血清编号为jh1308-012，冻存管顶部分别标有012-1、012-2和012-3。3.3运输和保存。3.3.1如果初筛试验能在24小时内完成，并将样品运输到上级单位，则样品在运输前应保存在2-8的冰箱中，样品应低温运输。3.3.2如果不能及时运送，运送前应将标本保存在-20的冰箱中，用干冰或低温冷藏运输。3.3.3对于样品的长期保存，应记录剩余血清的量和在盒中的位置，并保存在-70以下的冰箱中。3.3.4所有样品的运输和储存应符合国家相关生物安全法规。4注意事项4.1使用后，应将注射器和针头放在防穿刺容器中，最后高压灭菌。在任何情况下，你都不应该再试图给针头盖上盖子。4.2采血后

11、，摘下手套，丢弃在耐高压的垃圾袋中，进行集中高压灭菌，并立即用肥皂和水洗手。4.3如有针刺、皮肤损伤或其他损伤，立即用肥皂和水冲洗伤口，不要立即止血。4.4当血液污染身体任何部位或发生针刺等事故时，应及时报告上级，并按照医疗救护程序进行评估和抢救。附件2用酶联免疫吸附试验检测登革病毒ns1抗原的标准操作程序1目的酶联免疫吸附法检测患者血清中登革病毒ns1抗原。2适用范围适用于患者血清或血浆中登革病毒ns1抗原的快速检测。3实验前的准备3.1检查患者的姓名、序列号和检测项目(血清或血浆)。3.2测试前，应将待测样品置于2-8的冰箱或冰中。4测试项目和参数该方法的检测项目是检测血清或血浆中的登革热

12、病毒抗原。5测试设备和材料进样器、培养箱、洗板机、波长为450纳米的酶标仪、登革热病毒抗原检测试剂盒(万泰公司)检测到6种环境条件生物安全二级实验室(bsl-2)，灭活样品在生物安全一级实验室(bsl-1)进行。7个操作步骤7.1取出冰箱中的试剂盒，让其在室温下平衡30分钟，并在使用前轻轻摇动和混合试剂。7.2配液：用蒸馏水稀释试剂盒中的浓缩洗涤液20倍。7.3否：对微孔板对应的样品进行编号，每个板上有3个阴性对照孔、2个阳性对照孔和1个空白对照孔。7.4稀释剂：除空白孔外，在每个孔中加入50l稀释剂。7.5样品添加：向相应的孔中添加50l待测样品或50l阴性和阳性对照，空白孔除外。7.6孵育

13、：用密封膜密封平板后，在37孵育60分钟。7.7除空白孔外，在每个孔中加入50l酶标试剂，轻轻摇动并混合均匀。7.8孵育：用密封膜密封平板后，在37孵育30分钟。7.9洗版：小心地取下密封膜，用洗版机洗5次，最后一次尽量晾干。7.10显色：在每个孔中加入50l显影液a和50l显影液b，轻轻摇动并混合均匀，在黑暗中37显色15分钟。7.11测定：在每个孔中加入50l的终止溶液，并在10分钟内测定结果。将微孔板读数器的波长设置为450纳米(建议使用双波长450纳米/600-650纳米进行检测)，用空白孔调零后测量每个孔的a值。8结果判断8.1临界值的计算：临界值=0.10。负控制孔a值的平均值(如

14、果负控制孔a值低于0.05，则按0.05计算)。8.2阴性对照的正常值范围：阴性对照孔a0.1(如果一个孔a大于0.1，在下列情况下应重复实验用胶体金免疫层析法检测登革病毒ns1抗原的标准操作程序1目的患者血液中登革热病毒抗原的检测。2适用范围患者血清、血浆和全血中登革热病毒抗原水平的检测主要用于登革热病毒感染的辅助诊断。3实验前的准备3.1检查患者的姓名、序列号和检测项目(血清或血浆)。3.2测试前，应将待测样品置于2-8的冰箱或冰中。4测试项目和参数该方法的检测项目是检测血清或血浆中的登革热病毒抗原。5测试设备和材料登革热病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)检测到6种环境条件生物安全二级实验室(

15、bsl-2)，灭活样品在生物安全一级实验室(bsl-1)进行。7个检测步骤7.1从冰箱中取出试剂盒和待测样品，并平衡至室温。7.2准备测试时，打开密封的铝箔袋，取出测试卡，平放在水平桌面上。7.3在测试卡上标记患者的样本号。7.4样品添加：用滴管从样品中取出一滴(约30-45l)血清或血浆样品，将其添加到测试卡/试纸上的样品添加区域，并添加另一滴(约30-45l)稀释剂，以确保操作过程中不会产生气泡。(如果30秒后您没有看到样品移动，可能是因为样品太厚，所以您可以在样品添加孔中再添加一滴样品稀释剂。7.5添加样品后20-25分钟内解释结果，并对结果拍照。8结果说明8.1阴性结果：只有肉眼可见的

16、条带出现在质控线c中8.2阳性结果：质控线c和检测线t均出现可见条带.8.3无效结果：无形质量控制线c8.4质量控制：出现以下情况时，请使用实验室准备的阳性和阴性样品，按照上述操作步骤控制该批产品的质量：8.4.1新检查员使用该产品。8.4.2使用新的产品批号。8.4.3试剂卡的储存温度在2-30之外。8.4.4试验区域的温度在2-30之外。9含义阳性结果表明检测到登革病毒抗原，结合临床实践可诊断出登革病毒感染。阴性结果表明未检测到登革热病毒抗原，但不能排除登革热病毒感染。附件4用逆转录聚合酶链反应对登革病毒核酸进行分型和检测的标准操作程序1目的从登革热患者和/或媒介伊蚊提取病毒核酸并进行聚合酶链反应分型。2适用范围它适用于检测病人的血液样本及其培养基样本。检测到3种环境条件从标本中提取登革病毒核酸的实验要求在bsl-2实验室进行，聚合酶链反应分型检测应在专门的聚合酶链反应室或区域进行。4个实验步骤4.1实验准备4.1.1从标本中提取登革病毒核酸需要bsl-2实验室，聚合酶链反应分型应在综合实验室或专用聚合酶链反应室的独立区域进行。4.1.2在进入实验现场之前，事先准备好所需的试剂和样品。预约实验场地，看看之前的实验者是否已经清理了场地。4.2核糖核酸提取4.2.1使用微量病毒核