细胞凋亡实验

1、细胞凋亡与检测方法,汇报人：,凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。 坏死（Necrosis）：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。,一、细胞的死亡方式,二、细胞坏死与凋亡的比较,三、细胞凋亡的生理意义,1. 确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成 2. 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞 3. 发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡,细胞变圆 微绒毛消失 胞质浓缩 空泡化,凋亡小体,初期：,核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小,中期：,胞膜内陷出芽,浓缩核裂解膜自行分割,后期：,邻

2、近的上皮细胞、M、瘤细胞等吞噬凋亡小体,四、凋亡时细胞的主要变化（一）形态学改变,Normal Cell,Apoptotic cell,（二）、生化改变,、DNA片段化主要特征 2、内源性核酸内切酶（nase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活,内源性核酸内切酶的作用,H1,核心颗粒,连接区,180-200 bp,内源性核酸内切酶,Zn2+,Ca2+ Mg2+,五、细胞凋亡的检测方法,1、形态学检测 （一） HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状） （二）透射电镜观察 （三）荧光显微镜观察,透射电镜观察,凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（pro-apopto

3、sis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,荧光显微镜,期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态; a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化; b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）,2、DNA片断化检测,细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50300 kbp长的DNA大片段, 或180200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表

4、现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成,3、流式细胞仪检测 flow cytometer,（一）PI 单染 （二）Annexin/ PI双染色,（一） PI 单染,荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化

5、乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。 细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。 乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。,判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。 （检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）,（二）Annexin/PI双染色,原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活有关。Annexin是一种Ca2依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。

6、PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏, 可用PI区分。,检测标准： 早期凋亡细胞：Annexin -FITC (+)；PI (-)； 坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞： Annexin -FITC (+)；PI (+)； 机械性坏死及非特异性染色： Annexin -FITC (-)；PI (+)； 正常细胞：Annexin -FITC (-)；PI (-)；,C-myc ASO 200 nmol/L,凋亡结果,坏死结果,4、线粒体膜势能的检测,线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导

7、不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光（527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）. JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体的膜电位（）具有极性，JC-1依赖于的极性被迅速摄入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧

8、光（590 nm，线粒体）和绿色荧光（527 nm，胞液）. 而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，线粒体内红光强度减弱（590 nm），以单体的形式存在于胞液内而发绿色荧光（527 nm）. 因此在双色滤光片下观察，正常细胞为高绿高红，凋亡细胞为高绿低红.,正常细胞为高绿高红，,凋亡细胞为高绿低红.,5、Caspase-3活性的检测,Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。,Western blot 分析 caspase-3的活化Caspase 3，6，7,Caspase-3正常以酶原(32KD),活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽