中国药科大学生物制药工艺实验指导

1、第二部分是生物制药制备实验第一节氨基酸及其衍生物实验22固定化细胞法生产左旋天冬氨酸和左旋丙氨酸注：本实验来源于固定化细胞生产天冬氨酸和丙氨酸(国家重点项目)实验目的1.学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法。2.了解酶法生产这两种氨基酸的原理以及细胞固定化的原理和优点。3.掌握固定化细胞技术。实验原理固定化细胞技术是一种利用物理或化学手段在有限的空间内定位游离微生物细胞和动物细胞，并保持其活性和可重复使用的技术。固定化细胞的制备方法主要有：吸附法、共价交联法、絮凝法和包埋法；交联可以是细胞之间通过离子相互作用或与表面共价连接的连接，或者是由天然或化学试剂诱导的细胞之间的连接。吸附法是将细胞通

2、过静电相互作用(范德华力、离子键和氢键)吸附到载体表面。这种方法简单又便宜，但经常发现细胞渗漏；絮凝是一种利用某些微生物细胞絮凝形成颗粒的能力来固定细胞的方法；包埋法是近年来发展迅速的一种新的细胞固定化技术。它在保护性基质结构或胶囊中捕获细胞，减少细胞渗漏。因此，它具有操作简单、对细胞活性影响小、效率高的特点。它是目前细胞固定化研究和应用中应用最广泛的方法之一。L-天冬氨酸是一种天然的重要氨基酸，广泛应用于食品、医药、日化工业、纺织等行业。门冬氨酸钾镁盐在细胞代谢中起重要作用，是钾和镁的有效补充，适用于各种心脏病。在食品中，L-天冬氨酸作为食品添加剂可以改善食品风味，L-天冬氨酸和D-丙氨酸可

3、以合成L-天冬氨酰-D-丙氨酸甲酯(其甜度是蔗糖的150倍)，是一种新型甜味剂。在化学工程中，左旋天冬氨酸也可用作制造合成树脂的原料，其衍生物也可用于合成定量表面活性剂和制造化妆品。化学合成和微生物发酵被用于工业生产左旋天冬氨酸。随着固定化酶和固定化细胞技术的不断改进和发展，人们开始利用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将富马酸铵转化为左旋天冬氨酸用于工业生产。L-丙氨酸是脂肪族非极性氨基酸，是丙酮酸代谢系统中的非必需氨基酸。它在血液中含量最高，与糖代谢密切相关，这使得转氨作用中重要的氨基供体具有重要的生理功能。同时，它也是一种重要的氨基酸类药物，是各种复合氨基酸输液的重要成分，可作为多种医药中间

4、体。本实验利用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和天冬氨酸-脱羧酶产生菌制成固定化细胞，利用生物反应器连续生产天冬氨酸和丙氨酸。实验材料1.装备(1)一个水浴振荡培养箱(2) 1个磁力搅拌器(3) 1高效液相色谱(4) 5个250毫升的三角烧瓶(5)一个抽吸过滤瓶(6) 1台离心机(7) 2个布漏斗(8) 1个恒温水浴锅(9)一个酶柱(10) 1个烧杯1 000ml 1(11)两个500毫升烧杯(12)两个250毫升的烧杯(13) 1个超恒温水浴(14) 1台恒流泵(15) 1个高压釜(16) 1把锋利的刀(17) 12个试管2.试剂(1)菌株(2)玉米浆(3)富马酸铵(4)磷酸吡哆醛(5)牛肉提取物

5、(6)KH2PO4(7)硫酸镁(8)浓氨水(9)氯化钾(10)氯化镁(11)浓硫酸(12) 95%乙醇(13)l-天冬氨酸标准物质(14)富马酸标准(15)l-丙氨酸标准物质实验方法1.细菌培养和细菌制备将1毫升对数生长期产生天冬氨酸酶的菌株接种到250毫升锥形烧瓶中，该烧瓶含有50毫升灭菌培养基(1%富马酸铵、2%玉米浆、2%牛肉膏、0.5%KH2PO4、0.05%硫酸镁7H2O、pH7.0)，在37培养24小时，并离心(3000转/分钟)将对数生长期产生L-天冬氨酸-脱羧酶的1毫升stra20min分钟接种到含有50毫升灭菌培养基(1.5% L-谷氨酸钠、0.5%富马酸铵、1%富马酸钠、3

6、.0%玉米浆、2%蛋白胨、0.05% KH2PO4、0.01%硫酸镁7H2O、ph)的250毫升锥形瓶中2.固定化细胞的制备(1)天冬氨酸酶产生菌的固定化将4g湿菌悬浮在4ml生理盐水中，保持在45恒温水浴中，将0.8g卡拉胶在17ml生理盐水中加热至70-80溶解，然后冷却至45，将两者在45下混合均匀。将混合物置于4冰箱中30分钟，将凝胶在100毫升100毫升0.3毫升/升KCl溶液中浸泡4小时，然后切成3毫米3毫米。用生理盐水洗涤后，将固定化细胞置于1毫升/升富马酸铵中，在37活化24小时。(2)天冬氨酸-脱羧酶产生菌的固定化将5克湿菌悬浮在5毫升生理盐水中，保持在45的恒温水浴中，将0

7、.8克卡拉胶放入17毫升生理盐水中加热溶解，冷却至45，将两者在45下混合均匀，将混合物放入4的冰箱中30分钟，将凝胶浸泡在100毫升0.3毫升/升KCl溶液中4小时，然后切成3毫米3毫米的立方体。用0.1摩尔/升甘氨酸充分洗涤后，用1摩尔/升天冬氨酸铵(含0.1摩尔/LPLP)底物在37活化24h后即可使用。3.酶活性的测定(1)湿细菌天冬氨酸酶活性的测定将0.5g湿细胞悬浮在2ml蒸馏水中，加入30ml含有1mol/L氯化镁和1% triton的1.0mol/l富马酸铵，在37下搅拌30分钟，煮沸以停止反应，以1200rpm离心5分钟，在240nm下测量稀释的上清液，并根据富马酸的残留量计

8、算酶活性。一个酶活性单位被定义为在测量条件下(2)固定化细胞天冬氨酸酶活性的测定将相当于0.5g天然细胞的固定化细胞放入30ml含1mol/L氯化镁的1.0mol/l富马酸铵中，在37下搅拌反应30分钟，然后快速过滤除去固定化细胞，分离反应液，稀释后在240nm处测定富马酸的残留量，并计算每克固定化细胞的酶活性。总活性以每单位小时每克固定化细胞产生的l-天冬氨酸微摩尔数(mol/hgcell)表示。(3)绘制富马酸的标准曲线富马酸的吸收在240纳米处有一个特征峰，在一定范围内与富马酸的含量呈线性关系，反应体系中没有干扰。标准曲线的绘制管号123456富马酸标准溶液(50g/ml)012345蒸

9、馏水543210OD240nm纳米根据测得的吸收值，制作标准曲线或回归方程。(4)湿菌中L-天冬氨酸-脱羧酶产生菌活性的测定将1g湿菌悬浮在10ml生理盐水中，取0.5ml悬浮液，加入2ml含有1mol/L天冬氨酸铵和0.1mol/L PLP(ph 6.0)的底物，在37反应30分钟，通过煮沸终止反应。产生的l-丙氨酸通过纸色谱定量测定。显影剂为正丁醇：乙酸：水=4:133601，显影剂为0.5%茚三酮溶液。干燥后，切去显色斑点，用0.1%硫酸铜5H2O 336075%乙醇=2:38洗脱，然后在520纳米处比较颜色，然后从标准曲线中读取左旋丙氨酸。天冬氨酸-脱羧酶产生菌株的活性定义为：每小时每

10、克细胞产生1摩尔/升丙氨酸是一个酶活性单位。(5)固定化细胞天冬氨酸-脱羧酶活性的测定在20毫升生理盐水中加入6克固定化细胞(相当于1克湿细胞)，保持温度在37，加入4毫升含0.1摩尔/升PLP的1摩尔/升L-天冬氨酸铵，在37反应30分钟，快速过滤出固定化细胞，分离反应液，用纸层析定量测定生成的L-丙氨酸。(6)绘制左旋丙氨酸标准曲线根据方法(5)，通过纸色谱定量测定色斑脱色后520纳米处左旋丙氨酸含量与比色法之间的关系。标准曲线的绘制管号123456L-丙氨酸标准溶液(40克/毫升)012345蒸馏水543210OD520nm纳米根据测得的吸收值，制作标准曲线或回归方程。4.左旋丙氨酸的制

11、备将6g天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-脱羧酶的固定化细胞放入带夹套(1.5cm30cm)的固定化生物反应器中。将1.0摩尔/升富马酸铵(含1摩尔/升氯化镁，pH9.0)的底物以恒定流速通过天冬氨酸酶固定化细胞柱，SV=0.87h小时-1，然后将流出液通过0.1摩尔/升天冬氨酸酶和28%氨水，使pH6.0。思考问题1.分别计算了湿菌的天冬氨酸酶活性、固定化细胞的天冬氨酸酶活性、湿菌的天冬氨酸-脱羧酶产生菌活性和固定化细胞的天冬氨酸-脱羧酶活性。2.分别计算了两种细菌包埋后的活性回收率。3.分别计算了左旋天冬氨酸和左旋丙氨酸的转化率。第二节多肽和蛋白质药物实验23重组水蛭素的制备注：本实验内容来源于校

12、企合作课题，部分成果已获得专利实验目的1.了解工程菌发酵培养的工作原理、重组水蛭素的外分泌表达、表达蛋白的制备、抗凝血酶活性的测定、SDS-PAGE电泳分析和鉴定。2.掌握基因工程菌的发酵培养条件，分泌表达目的蛋白，并对表达的蛋白进行分析鉴定。实验原理水蛭素是由水蛭唾液腺分泌的一种低分子量酸性单链多肽。1904年，Markwardt首次分离并纯化了它，1970年，证实水蛭素是迄今为止发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，即使在低浓度下也能完全防止血液凝固。药理和临床研究表明，水蛭素能有效防止静态动脉血栓形成和弥漫性血管凝固，而不会引起过敏、免疫反应和循环功能障碍。可用于治疗不稳定型心绞痛(美国)、急

13、性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等。它是一种良好的抗凝血和抗血栓药物。水蛭素的分子量约为7000道尔顿，含有65 66个氨基酸残基。水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝血活性起着决定性的作用，而N端的三个二硫键是决定二级和三级结构及其稳定性的关键。二硫键的氧化或分子的蛋白质降解将导致抗凝血活性的丧失。如果碳末端羧基被酯化或碳末端氨基酸丢失，与凝血酶的结合能力也将丢失。水蛭素在干燥状态下稳定，在室温下可在水中稳定存在6个月，在80加热15分钟不会被破坏。随着酸碱度的增加，稳定性降低，在0.1摩尔/升盐酸溶液或0.1摩尔/升氢氧化钠溶液中

14、稳定15分钟。水蛭素不被胰蛋白酶水解，对-糜蛋白酶有一定的耐受性，但木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A能使其失活。由于天然水蛭素来源非常困难，每只水蛭只含20g水蛭素，不能满足临床应用。因此，许多国外公司和研究单位从20世纪80年代末开始研究利用基因工程技术生产重组水蛭素。目前，在国外上市的水蛭素产品包括赫氏公司的重组水蛭素和诺华公司的重组水蛭素。1997年，我院合成了重组水蛭素基因，构建了大肠杆菌外分泌表达系统。分泌型重组水蛭素基因工程菌表达产物重组水蛭素的相对分子质量为7 010.8Da。该工程菌株是一个外分泌表达系统，其基因表达产物rHV3易于纯化。然而，表达系统会产生一些杂质蛋白和色素，这将影响下游的分离和纯化。在提取纯化过程中，采用大孔吸附树脂疏水层析和离子交换层析，较好地解决了杂质蛋白和色素的分离。大孔吸附树脂是rHV3的第一步提取，高分子量的外源蛋白基本被去除，离子交换是脱色素的关键。吸附和离子交换中合适的洗脱条件是提高活性产率的重要因素。该纯化方法工艺简单，重组人V3的收率和纯度高，适合大规模制备重组人V3。本实验以工程菌为材料。首先，对工程菌进行发酵和培养，然后将发酵液离心以从工程菌发酵液的上清液中分离和纯化重组人V3。发酵上清液经大孔