SDS-PAGE 原理 步骤 详细介绍 含图片.ppt

1、A,1,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-PAGE,A,2,一、什么是SDS,十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在,A,3,SDS的作用,破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物,A,4,一、SDS-PAGE的基本原理,（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素

2、可以被忽略,A,5,1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构,A,6,2、强还原剂 巯基乙醇（-mercaptoethanal） 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂,A,7,A,8,SDS和还原剂的作用：（1）分子被解聚或组成它们的多肽键（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异,A,9,蛋白质-SDS胶束的特点（1）形状像一个长椭圆棒（2）短

3、轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,A,10,胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,A,11,3、影响SDS电泳的关键因素（1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4（2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度,A,12,（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定

4、量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。,A,13,（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的,A,14,电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍 4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品 5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量,A,15,（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只

5、取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度,A,16,A,17,A,18,A,19,A,20,（四）分子量测定1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。 蛋白带迁移距离Rf= 溴酚蓝迁移距离,A,21,蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= X 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离,A,22,2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图,A,23,A,24,3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量,A,25

6、,A,26,二、去污剂的选择无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC）阴离子去污剂：SDS deoxycholate,A,27,三、方法1、分类（1）根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳,A,28,（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 连续电泳 不连续电泳（3）根据电泳的形式 圆盘电泳 垂直电泳 平板电泳 水平电泳,A,29,A,30,A,31,A,32,2、操作（1） 制备分离

7、胶（2） 制备积层胶(堆积胶）,A,33,A,34,A,35,A,36,A,37,分离胶聚合之后,A,38,A,39,A,40,A,41,A,42,A,43,A,44,A,45,（3） 加样品样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球型,A,46,还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或-二巯基乙醇后，蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离,A,47,带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带,A,48,非还原的SDS处理 许多样品

8、，如生理体液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠,A,49,（4） 电泳 （5） 固定,A,50,（6） 染色考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue）R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上,A,51,A,52,G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。,A,53,A,54,银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上,A,55,A,56,（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定,A,57,3、电泳过程中的不正常现象（1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好,A,58,（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片