质粒DNA的提取和PCR技术

1、质粒DNA的提取和PCR技术，质粒提取，基本原理操作程序注意事项实验室安全，基本原理细菌质粒是一种双链，闭环DNA，大小范围在1kb到200kb以上。 各质粒存在于细胞质中，是独立于细胞染色体的自主复制的遗传成分。 质粒是目前最常用基因克隆的载体分子，碱分解法是最常用的方法。 基本原理是，用NaOH和SDS溶液分解菌体后，蛋白质和线性DNA发生变性，质粒向上清中排出。 加入中和液后，闭环质粒DNA分子即使氢键被破坏，双链也不分离。 迅速恢复，成为溶解状态，离心时可以残留在上清中的蛋白质和染色体DNA的变性相互缠绕在高分子复合体上被SDS复盖，加入溶液后变成PDS离心后就会沉淀。 试剂的准备：1

2、.调节溶液： 50mM葡萄糖的平衡渗透压，调节PH，有利于悬浮。 调节了25mm tris-HCl (ph8.0) p h 10 mm EDTA (ph8.0)蓝色和离子抑制DNase活性高压灭菌15min，4 .溶液：0.2N NaOH，1% SDS分解细菌，改性线性DNA 3.溶液：醋酸钾(KAc)3M，pH 4.8 SDS作用和沉淀的4 .酚/氯仿/异戊醇(25:24:1 )酚改性提取蛋白是tris-base平衡酚。 氯仿防止苯酚和水的相互溶解。 异丙醇的作用是通过降低表面张力，减少泡沫5 .异丙醇、乙醇(无水乙醇、70%乙醇)沉淀质粒6.TE:10mM Tris-HCl(pH 8.0

3、)、1mM EDTA(pH 8.0 ) RNase A:10mg/ml，操作程序和注意事项1选择单一菌落，接种到含有相应抗生素的LB培养基中，37处振荡培养1418 h。 -培养时间不要太长。 否则，细菌就会老化，代谢产物太多。 影响质粒的质量。 将1.5ml的培养物放入微量离心管中，在室温下离心12000g1min，丢弃上清液，将离心管倒置，尽量使液体流走。 3 .将细菌沉淀物悬浮在100l的预冷溶液中，剧烈振动，使菌体分散混合。 加入200l新鲜配制的溶液，搅拌几次(不要剧烈振动)，将离心管放在冰上2-3min，撕裂细胞膜，使DNA变性。 -请不要延长放置时间。 因为在碱性条件下基因组DN

4、A逐渐被切断。 混合动作是软件的，必须保证细菌沉淀在试剂中充分扩散，不要机械切断改性的质粒DNA和染色体基因组DNA。 加入150l预冷的溶液，将管温和混合数次，看到白色棉状沉淀，在冰上放置3-5min。 形成中和溶液、此时质粒DNA的复原性、染色体和蛋白质的不可逆变性、不溶性复合体，同时k使SDS蛋白质复合体沉淀。 用6.12000g离心10min去除上清，加入等体积的苯酚/氯仿/异丙醇，振荡搅拌，4离心12000g10min。 -提取剩下的蛋白质。 7 .小心将上清转移到新的微量离心管中，加入0.50.7倍体积的异丙醇，混合，4离心12000g、10min。 -无水乙醇加倍体积，在室温下离

5、心2-5min。 为了不过度沉淀，用8.1ml 75%乙醇洗涤一次沉淀，离心4次，丢弃上清，在室温下干燥沉淀。 -不要太干，不容易融化。 9 .沉淀溶解于20lte (含20g/ml rnasea )中，37水浴在30min下分解RNA分子，保存-20分钟。 10 .琼脂糖凝胶电泳检查。 检查，定量。 其他注意事项： 1。 质粒品质：首先，实验菌种的生长好坏直接影响质粒DNA的提取，因此有必要激活保存时间长的菌种。 其次操作过程注意：避免基因组断裂，去除蛋白质，清洗盐离子。 质粒数：等量摇菌量中的质粒量取决于质粒的拷贝数。 低拷贝数质粒可以通过添加氯苯酚来增加拷贝数。 二。 阳性菌破壁开裂比较

6、困难，首先可以用溶菌酶处理。 溶液2中的NaOH不要太暴露在空气中。 与空气中的CO2和NaOH发生作用，有可能削弱碱性。 三。用琼脂糖电泳鉴定质粒DNA时，以电泳速度排列的三条带分别是超螺旋、开环、复制中间体(即，复制没有完全的两条质粒连接)，因此用碱法提取的质粒样品中包含线性DNA 实验室安全性： 1。 培养细菌的容器使用后必须立即灭菌。 细菌培养基上清不要随意丢弃，要一起灭菌处理，避免污染环境。 二。 吸苯酚的时候要注意安全。 苯酚的腐蚀性很强。 吸入氯仿异戊醇时用通风箱进行，氯仿会引起引起神经系统功能障碍的肝脏障碍。 异丙醇对眼睛、皮肤、粘膜、呼吸器有刺激作用。 注意电泳时避免EB污染

7、。PCR技术、基本原理反应动力学的使用程序和注意事项反应参数要素PCR的优化、PCR技术、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR )是80年代中期发展的体外核酸扩增技术。 在一个具有特异、敏感、收率高、快速、简便、再现性好、容易自动化等优点的试管内，将研究的目的基因或某DNA片段在几小时内放大到十万至百万倍，可以用肉眼直接观察判断。 -可用于基因克隆、目的基因检测等。 发展： Taq DNA聚合酶：分离为温泉菌，达到高温。 PCR和TaqDNA聚合酶被列为美国科学杂志1989年的“年度分子”，80年代10项重大科学发明的第一项，基本原理：类似于DNA的自然复制

8、过程，其特异性依赖于目标序列的两端和互补的寡核苷酸引物。 PCR由改性退火拉伸三个基本反应步骤组成：模板DNA的改性：将模板DNA加热93左右的一定时间后，使模板DNA的双链或PCR扩增的双链DNA解离，形成单链与引物结合， 准备下一次反应的模板DNA和引物的退火(复原性):模板DNA经加热变性为单链后，温度下降到55左右，引物和模板DNA的单链的互补序列结合的引物的伸长： DNA模板-引物结合物是TaqDNA聚合酶的以目标序列为模板，根据碱基对和半保留复制的原理，合成新的模板DNA链和互补的半保留复制链，重复循环改性退火，得到更多的“半保留复制链”，并且这种新链将成为下一个循环的模板。 完成

9、一个周期需要24分钟，23小时就能把目的基因扩增到数百万倍。 PCR的反应动力学：重复PCR的三个反应步骤，使DNA扩增量呈指数上升。 反应的最终DNA放大量可以用Y(1X)n计算。 平均放大效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率没有达到理论值。 反应曲线：反应初期，目标序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的积蓄，扩增的DNA片段不呈指数增加，进入线形成长期或静止期，即“停滞效果”的效果被称为平台的期间数(原因： PCR扩增效率和DNA多聚相机操作步骤的注意事项： 1。 配置反应系统。 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液1ul4种dNTP混合物200umol/L底漆各11

10、0pmol模板DNA 10200ng Taq DNA聚合酶0.25uMg2 1.5mmol/L之外，加入水直至10ul 2。 用加热到90以上的PCR计预备变性94分钟，循环： 94 1分钟、50 1分钟、72 1.5分钟，共计30次。 3 .循环结束后，保存72 10分钟，4分钟。 4、电泳结束后进行观察，注意问题： 1。 核酸污染防止： PCR反应的最大特点是具有大的扩增能力和极高的灵敏度，但头痛问题容易污染，极微量的污染导致假阳性的发生。 吸引枪：吸引枪的污染值得关注。 操作时错误地将样品和铸型核酸吸入枪内，或者把枪口贴在一起是严重的污染源。吸引口、小离心管请一次使用。 开关盖子时，注意

11、不要接触内壁，另外，打开盖子的时间不要太长。 二。 预先调制预混合分注PCR试剂：PCR反应液，少量分注。 节省时间，保证各管道成分平行。 为了防止加入酶后马上开始反应，最好在加入样品时在冰上低温下进行。 三。 阳性对照和阴性对照的设立。 -重要！ 有利于问题的解决，有助于条件的优化和排除污染的可能性！ 反应参数要素： 1。 PCR反应5要素(1)Taq酶：酶量：催化典型的PCR反应需要约酶量2.5U (指总反应体积为100ul时)，浓度过高时会发生非特异性扩增，浓度过低时合成产物量减少。 真实性： rTaq-12kbp、LaTaq-20kbp、Pfu(Pyrobest)-吸附时要注意，保存在

12、甘油中会变得粘稠。 (2)dNTP的质量和浓度：在PCR反应中，在一般的反应中，每个dNTP的最终浓度为20-200mol/L。 4种dNTP的浓度相等(等摩尔调制)，任一种浓度与其他种类不同(过高或低)时，会引起失配。 (3)模板是含有DNA片段、基因组、质粒、噬菌体、菌液等DNA的生物样品。 无论是单链分子还是双链分子，线性分子，环状分子一般反应中的模板数都可以是102 -105复制。 模板的纯化程度影响放大效率。 4)Mg2浓度： Mg2对PCR扩增的特异性和产量有显着影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2浓度以1.52.0mmol/L为宜。 Mg2浓

13、度过高时，反应特异性降低，出现非特异性扩增，过低时，Taq DNA聚合酶的活性降低，反应生成物减少。 (5)引物： PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 最佳底漆浓度通常为0.10.5m。 最低底漆量的产生所需要的结果是，底漆浓度高时会发生失配和非特异性的扩增，优选底漆间形成二聚体的机会增加。 底漆设计的好坏是决定PCR成败的最重要因素。 底漆设计原则：1)底漆的长度约为18-30bp。 2 )引物中的G C含量通常为40%-60%，G C过少时扩增效果差，G C过多时容易出现非特异性条纹。 GC含量为引物的解链温度tm4(gcc)2(att).3)4种碱随机分布，在3个末端不

14、连续存在g和c，容易引起错配。 4 )引物的3个末端，为了减少因密码子摆动引起的不匹配，希望与目的序列读书帧的密码子第一位或第二位核苷酸对应。 5 )底漆内，特别是3端不存在二次结构。 6 )两个引物之间，特别是3末端不互补，防止引物二聚体的出现，减少产量。 7 )引物的5个端部对扩增特异性影响不大，因此在引物的设计时可加入限制酶部位，通常应在5个限制酶部位外加入12个保护碱。 8 )引物与模板结合部位以外的序列不互补。 扩增产物本身没有稳定的二级结构，不引起非特异性扩增，不影响产量。 底漆设计软件： primer5.0、6.0、2。 PCR反应条件的选择：温度、时间和循环次数温度和时间：改性

15、温度：一般9394lmin足以改性模板DNA。 过低的解链不完全，会影响酶的活性。 退火温度和时间：退火温度影响PCR特异性。 过高则恢复性不好，过低则有非特异性的结合。 提高退火温度可以提高特异性。 退火的温度和时间取决于引物的长度、碱组成及其浓度、靶序列的长度。 选择合适的温度： Tm值(解锁温度)=4(G C)2(A T )再现性温度=Tm值-(510 )在此范围内进行优化。 提高退火温度可以提高特异性。 恢复性时间一般在3060sec的拉伸温度和时间：一般在7075之间，常用温度为72。 拉伸速度通常为1kb/min。 伸长的时间过长会出现非特异性的放大带。 放大低浓度模板需要一点时间

16、。 循环次数：循环次数决定PCR放大的程度。 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选择在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量也越多，PCR的优化和特异性问题1。 目的波段没有放大： (1)引物的设计合成没有问题。 (2)模板：模板中含有杂质蛋白质，含有Taq酶抑制剂。 放大的模板中含有高GC含量或重复序列时，使用GC缓冲器。 (3)酶失活(4)退火温度过高2。 有目的带，但弱： (1)调节mg浓度(2)降低退火温度- (考虑增加触摸屏量，用增加延长时间的产物制造二次PCR.非特异性扩增(假阳性)的原因： (1)引物和目的序列不完全互补，或(2)Mg2离子浓度过高、

17、退火温度过低和PCR循环次数过多。 四。 用于放大磁带的所有磁带都模糊成带状或呈带状。 (1)底漆浓度不适当或退火温度不适当时，可以改变浓度或使用梯度PCR，用下降PCR寻找最佳条件。 (2)模板纯度不足，需要重新精制。 (3)酶量太多5。 阴性对试管中目的胶带被放大：原因：器具，如管道、枪等有污染，或与其他试管相互污染。 一些PCR: 1.下降PCR:-特异性通过在PCR的前几个循环中使用严格的退火条件来提高特异性。 循环以比估计的Tm高约5的退火温度开始，各循环各下降12，直到退火温度低于Tm 5。 这样，特异性最高的目标模板优先被放大，在之后的循环中放大占优势。 2 .嵌套PCR:-特异性nPCR被称为嵌套PCR，因为它首先用一对引物进行第一次PCR，然后再用一对引物放大的DNA序列内部的一对引物扩散。 由于使用两组引物进行