第2章 蛋白质的构件-氨基酸

1、第2章蛋白质的构件氨基酸,(AminoAcid,AA,Aa,aa),一、旋光异构,原子组成、分子式、分子量相同,（一）有关旋光异构的几个概念,1、（同分）异构（isomerism）,结构异构：由于分子中原子连接的次序不同造成的，包括：碳架异构体、位置异构体和功能异构体。立体异构：又可分为几何异构（也称为顺反异构）和旋光异构（也称光学异构）。几何异构：是由于分子中双键或环的存在或其它原因限制原子间的自由旋转引起的。旋光异构：是由于分子存在手性造成的，最常见的是分子内存在不对称碳原子。,2、手性C原子（asymmetriccarbonatom),概念：也称为不对称碳原子，是指与四个不同的原子或原子

2、基团共价连接并因而失去对称性的四面体碳。常C表示。,3、旋光性（opticalactivity）,当光波通过尼科尔棱镜时，由于棱镜的结构只允许沿某一平面振动的光波通过，其它的光波均被阻断，这种光称为平面偏振光。,左/右旋当偏振光通过旋光物质的溶液时，则光的偏振面会向右旋转（顺时针方向或正向，符号+）或向左旋转(逆时针方向或负向，符号-),旋光度（旋光性、光学活性）,旋光物质使平面偏振光的偏振面发生旋转的能力。,4、构型和构象,构型：原子或基团在空间的相对分布或排列。对于旋光异构体来说，是指不对称碳原子的四个取代基在空间的相互取向。涉及共价键的断裂。构象：当单键旋转时，取代基团可能形成不同的立体

3、结构。不涉及共价键的断裂。,（二）Fischer投影式,这种投影式是德国化学家FischerE于1891年提出的。投影式可以看成是立体模型或透视结构在纸面上的投影。D（+）-甘油醛和L（-）-甘油醛的投影式和透视式如下：对于透视式，虚线键伸向纸面背后，楔形键凸出纸面，伸向读者。,（三）构型的RS表示法,虽然DL构型命名系统在反映旋光化合物之间的构型联系方面有它的优点，但其有存在很大的局限性。如酒石酸其C*2和C*3根据其与甘油醛的联系，一个为D构型，一个为L构型，但在实际测定中发现二者构型相同。,1956年科学家们于是提出了RS构型命名，这样可以准确无误地规定任何手性碳原子的绝对构型，具有普遍

4、适应的优点。,其具体的应用规则：第一步：指定与每个手性碳原子直接相连的4个取代基的优先性顺序。顺序规则的基础是原子序数高的原子比原子序数低的原子优先性大。第二步：旋转手性四面体碳，使那个优先性最小的取代基，离开观察者最远，另三个取代基面向观察者。,第三步：观察面向观察者的三个取代基按优先性大小的顺序是顺时针方向还是逆时针方向，如果为顺时针方向，则为R构型（R源自拉丁文Rectus,R,右），如果是反时针方向，则为S型（S源自拉丁文Sinister，左）,蛋白质的构件分子,ProteinArchitecture,二、氨基酸,蛋白质的元素组成,碳50-55%氢6-8%氧20-23%氮15-18%*

5、平均含氮16%硫0%-4%有些蛋白质还含有微量的磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素。蛋白质系数:6.25,蛋白质的元素组成特点,蛋白质的分类,根据蛋白质组成成分,根据蛋白质形状,以长轴与短轴之比为标准，前者小于5，后者大于5。要注意球状蛋白质不等于球蛋白。球蛋白是按溶解度分类的一类蛋白质。,根据结构分类,1单体蛋白：蛋白质由一条肽链构成，最高结构为三级结构。包括由二硫键连接的几条肽链形成的蛋白质，其最高结构也是三级。多数水解酶为单体蛋白。2寡聚蛋白：包含2个或2个以上三级结构的亚基。可以是相同亚基的聚合，也可以是不同亚基的聚合，如血红蛋白为四聚体，由2个亚基和2个亚基聚合而成（22）。3多聚蛋白：由

6、数十个亚基以上，甚至数百个亚基聚合而成的超级多聚体蛋白，如病毒外壳蛋白。,根据功能分类,活性蛋白和非活性蛋白两大类。属于活性蛋白质的有酶、蛋白质激素、运输和储存蛋白质、运动蛋白质和受体蛋白质等；属于非活性蛋白质的有角蛋白、胶原蛋白等。,蛋白质的生物学重要性,1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用（结构蛋白）6）参与细胞间信息传递,2.蛋白质

7、具有重要的生物学功能,3.氧化供能,蛋白质水解,蛋白质和多肽的肽键可被催化水解酸/碱能将蛋白完全水解酶水解一般是部分水解,得到各种AA的混合物,得到多肽片段和AA的混合物,氨基酸是蛋白质的基本结构单元,蛋白质月示胨多肽肽AA1*1045*1032*1031000200100-500,氨基酸的结构,地球上天然形成的AA300种以上。构成蛋白质的AA只有20余种，且都是-氨基酸。,氨基酸,a-碳原子,R基不同,a-氨基,共同点：与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因此称为-氨基酸,氨基酸同时含有氨基和羧基，所以它们能以首尾相连的方式进行聚合反应，除去一分子水形成一个共价酰氨键，也称之为肽键。,氨基

8、酸的构型,氨基位置,参照甘油醛,-C-C-C-C-COOH-C-C-C-C(NH2)-COOH-氨基酸-C-C-C(NH2)-C-COOH-氨基酸-C-C(NH2)-C-C-COOH-氨基酸,什么是-氨基酸？,大多数AA在中性pH时呈兼性离子状态:除甘氨酸外，19种AA都具有旋光性。除胱氨酸和酪氨酸外，其余AA都能溶于水。脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。,COO-,NH3+,氨基酸的分类,（一）常见的蛋白质氨基酸,需要记忆：P17页表2-2氨基酸的三字母符号和单字母符号,分为：脂肪族、芳香族和杂环族,按基的化学结构分类：,、脂肪族aa,（）中性脂肪族aa,（2）含羟基或硫aa,（）酸性a

9、a及其酰胺,（）碱性aa,、芳香族aa,、杂环aa,按基的极性性质分类：,、非极性基aa,、不带电荷的极性基aa,3、带正电荷的基aa,4、带负电荷的基aa,（二）不常见的蛋白质氨基酸,由常见aa经修饰而来。,存在于结缔组织的胶原蛋白中,存在于结缔组织的胶原蛋白中,甲基赖氨酸：肌球蛋白的成份。,羧基谷氨酸：凝血酶原中发现，也存在需要Ca2+的蛋白质中。,某些涉及细胞生长和调节的蛋白质可以在含氨基残基如丝氨酸上进行可逆性磷酸化，生成磷酸丝氨酸。,（三）非蛋白质氨基酸,200多种多是蛋白质中L型-AA衍生物有一些是-，-，-AA有些是D-型AA,如D-谷氨酸和D-丙氨酸，在细菌细胞壁的肽聚糖中发现

10、。,鸟氨酸瓜氨酸,尿素循环的中间产物。,记忆指导：1.两种酸性的氨基酸及它们的两种酰胺2.三种碱性氨基酸（多氨基）3.含苯环、杂环的4.含OH、S的5.不同碳架（链长、分支）。,氨基酸的结构特点,氨基酸的酸碱性质,（一）兼性离子,非离子型。,兼性离子型。,氨基酸在晶体和水中以兼性离子，也称为偶极离子的形式存在，极少数为中性分子。,（二）氨基酸的解离,（三）氨基酸的等电点,当溶液为某一pH值时，AA主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0。这一pH值即为AA的等电点（pI）。在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。,pI=(pK1+pK2)/

11、2,对于侧链含有不解离的中性氨基酸来说：,甘氨酸滴定曲线,10nmol苷氨酸,对于侧链含有可解离基团的AApI取决于两性离子两边pK值的算术平均值酸性AA：pI=(pK1+pKR-COO-)/2碱性AA：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,由实验测定:根据氨基酸羧基和氨基的pK值（即解离常数的负对数）来计算。一氨基一羧基氨基酸的解离、pK值及pI的计算公式如下:,氨基酸的pI值：,pI=(pK1+pK2)/2,二氨基一羧基氨基酸如赖氨酸，在不同pH值时的解离情况如图所示。,综上所述：各种氨基酸的等电点为两性离子两侧两个pK的平均值。每种氨基酸都有特定的等电点，当溶液的pH值低于某氨基酸的等电

12、点时，则该氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动。当溶液的pH值高于等电点时，则该氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动。当液的pH等于等电点时，氨基酸所带净电荷为零，在电场中不移动。,等电点的特点和意义：,溶解度最低，易沉淀，用于分离纯化等。等电点时不电泳，电泳液的pH值要偏离等电点。,与茚三酮的反应在570nm比色可知氨基酸的含量。该反应十分灵，几微克氨基酸就能显色。多肽或蛋白质也能与茚三酮反应，但肽越大，灵敏度也越差。,这是氨基酸的首选颜色反应,$7.氨基酸的化学反应,440nm,与甲醛的反应氨基酸是两性离子，不能用酸或碱滴定测其量。氨基酸可与甲醛反应，使溶液酸性增加，再以酚酞作指示剂用aOH来

13、滴定。由滴定所用的aOH量就可以计算出氨基酸的含量甲醛滴定法。,变通一下再滴定,与2，4-二硝基氟苯（DNFB）反应桑格反应可用于鉴定多肽链的N端氨基酸DNFB与-氨基反应黄色,有显著紫外吸收的氨基酸：Tyr275nmPhe257nmTrp280nm,氨基酸的吸收光谱,是紫外法测定蛋白质含量的理论基础,蛋白质的特异吸收波长在280nm,氨基酸的紫外吸收光谱：,氨基酸的应用,1.医药工业2.化学工业3.食品工业4.农业5.化妆品工业,氨基酸输液-必需氨基酸治疗药剂精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果；天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。半胱氨酸：能促进毛

14、发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。,（1）医药工业,（2）化学工业,维生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。氨基酸表面活性剂聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂，稳定剂等。,营养强化剂；谷氨酸钠味精；天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素APM,（3）食品工业,（4）农业,杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨

15、酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果；杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；除草剂：如N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；,（5）化妆品工业,氨基酸能调节皮肤pH的变动，对细菌的防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。,、AA的光学活性和光谱性质,（一）AA的光学活性和立体化学,（二）氨基酸的光谱性质,可见光区：无吸收远紫外和红

16、外区：都吸收近紫外区（200400nm）：Tyr/Trp/Phe原因：-C=C-C=C-C=C-C=C-,1、紫外吸收光谱,R基含有苯环共轭双键系统。,只有芳香族氨基酸有吸收,Trp280nmTyr275nmPhe257nm,蛋白质含量测定,280nm,A=,A:吸光度；为摩尔吸光系数；c为浓度（mol/L）；l为吸收杯的内径或光程厚度。I0为入射光强度；为透射光强度。,单色仪,分光光度法定量分析所依据的是Lambert-Beer定律。,、核磁共振波谱,主要用于测定肽和小蛋白分子的三维空间结构。,$、氨基酸混合物的分析分离,利用AA成分分配系数的差异即基于氨基酸的溶解度性质。,（一）分配层析,

17、一、原理,分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。固定相极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等）能和多孔的支持物（常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等）紧密结合，呈不流动状态流动相非极性的有机溶剂,分配系数(a)指在一定温度和压力条件下物质在固定相和流动相两部分浓度达到平衡时的浓度比值。,分配系数较大的物质分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移动较慢分配系数较小的物质移动速度较快。,二、纸层析法,支持物厚度适当、质地均一、含金属离子(钙、铜、镁、铁等)尽量少的滤纸固定相滤纸中吸附着的水（约含2022%）流动

18、相常用的为酚、醇。,迁移率（Rf）各组分在滤纸上的移动速度Rf值的大小取决于该组分的分配系数。分配系数大者移动速度慢，其Rf值也小；反之分配系数小者，移动速度快，Rf值也大。,三、双向纸层析法,几种成分在一个溶剂系统中层析所得Rf值相近，不易分离清楚，可采用双向纸层析。在第一次层析后将滤纸吹干逆转90角，再采用另一种溶剂系统进行第二次层析,氨基酸双向纸层析图谱,（二）离子交换层析,一、原理,离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯

19、化的目的。,高分子聚合物基质、配基和平衡离子,平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，能与带负电的离子基团发生交换作用,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。,pH值的影响,离子浓度影响,离子浓度增加,离子交换剂的基质,琼脂糖离子交换剂,离子交换交联葡聚糖,聚苯乙烯,离子交换纤维素,1、离子交换纤维素,常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）CM-纤维素（羧甲基纤维素）,开放性长

20、链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过。亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。回收率高,优点：,2、交联葡聚糖,优点：,不会引起被分离物质的变性或失活非特异性吸附少交换容量大,离子交换葡聚糖的选用：,一般根据蛋白质的分子量而定中等分子量（30000-200000）一般选A50和C50低分子量（30000）和高分子量（200000）均宜选用A25和C25。,3、琼脂糖离子交换剂,优点：,对pH及温度的变化均较稳定，可在pH310和070范围内使用改变离子强度或pH时，床体积变化不大流速快，分辨率高

21、特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离。,4、聚苯乙烯,阴离子交换剂AmberliteIRA&Dowexleg.Dowexl4-100阳离子交换剂AmberliteIRC&Dowex50,强阴离子交换剂,交联度为4%,颗粒度为50-100目,5、其他,聚乙烯醇DEAE-Toyopearl&CM-Toyopearl富羟基高亲水性兼性离子交换剂基质上连有-丙氨酸、对氨基苯磺酸、精氨酸等偶极离子or凝胶网孔中包含阴、阳离子的磷脂的脂质体,三、离子交换介质的配基,提供了可交换的离子，是由带电荷的官能团组成通过或长或短的碳氢链经醚键结合到聚合物骨架上，相应的分别得到了阳离子和阴离子交换剂,

22、pK值决定了相应的离子交换剂的pH工作范围密度在配基密度达到一个极限值之前，蛋白质的吸附容量和保留值随着配基密度的增加而明显增加；过了极限值，蛋白质的吸附容量和保留值随配基密度的增加基本上没有影响。,种类一般对同类型的离子交换剂来说，强阳(阴)离子交换剂比弱阳(阴)离子交换剂对蛋白质的结合能力强，需较强的盐浓度进行洗脱，相对的选择性较高,四、基本操作,1、离子交换剂的选择,配基的选择取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。,基质的选择,颗粒大小,2、离子交换剂的处理,酸碱

23、浸泡进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。,膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。,水悬浮去除杂质和细小颗粒,3、缓冲液的选择,保证各个待分离物质的稳定；使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。,离子强度和pH,4、层析柱的选择,亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。,采用离子强度较大的梯度洗脱选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离