第三代基因编辑技术CRISPRCas9解析

1、第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9,专题内容,基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术,可以精确地定位到基因组的某一位点,并剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段,基因编辑技术,基因编辑工具,锌指核酸内切酶（ZFN）,类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）,成簇、规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein9（CRISPR/Cas9）,基因编辑工具,1987IshinoY等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列

2、,2005三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源,2002该结构被正式定义为成簇、规律间隔短回文重复序列（CRISPR）,2007Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抗噬菌体入侵。,2013Zhang研究组首次在人293T细胞与小鼠Nero2A细胞中利用Crispr/Cas9系统实现了基因定点突变。,Crispr/Cas9研究历史,II型CRISPR免疫,II型CRISPR免疫,Crispr/Cas9系统核心：Cas9核酸酶、sgRNA,CRISPR系统结构,(间隔相邻基序),Cas9切割后的DNA修复,编辑效率检

3、测,T7E1Assays,sgRNA设计,基因编辑流程,T7E1,Crispr系统应用,GeneticDiseases,Cancer,CardiovascularDisease,HIV,ViralDiseases,Immunodeficiency,Crispr系统应用,WenhuiHu,etal.PNAS.2014,111(31):11461-6,CRISPR/Cas9基因编辑技术能够有效利用其sgRNAs靶向作用于HIV-1原病毒LTR(长末端重复序列)区，对HIV-1原病毒进行有效清除。在感染HIV-1的细胞中使用携带2个sgRNAsCRISPR/Cas9系统可以明显抑制病毒复制与再生效率

4、。,Crispr系统应用,ChenSD,etal.Cell.2015March12;160(6):12461260,2015年，ZhangF与PhillipA.Sharp团队构建了一个包含67405个sgRNA的CRISPR文库，作用于一个不具有转移能力的肺癌细胞系。将处理后的细胞接种于免疫缺陷小鼠后，小鼠出现了明显的肿瘤转移表型。,建立癌症模型,Crispr系统应用,体外培养的人类正常肠道成体干细胞中通过CRISPR/Cas引入4个结肠癌基因突变(APC、P53、KRAS和SMAD4),建立结直肠癌类器官模型,MatanoM,etal.NatMed,2015,21(3):256262.,20

5、15年，Brandon等将CRISPR技术应用到了癌症相关的基因治疗研究，采用了慢病毒载体使CRISPR系统可以被Doxycycline诱导表达，对细胞进行编辑，实现抗凋亡基因MCL-1在体内体外的敲除。,BrandonJ,etal.CellRep,2015,10(8):14221432.,Crispr系统应用,Crispr系统应用,程序性死亡受体Programmeddeath-1(PD-1),主流治疗手段：抑制性单克隆抗体药物,临床实验,新型疗法,嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）,不良反应：细胞因子释放综合征,基因编辑技术应用在CAR-T上的成功案例：Cellectis公司UCART19,新型疗法,UCART19+TALEN,TCR,CD52,RQR8,降低排异反应,使细胞对阿仑单抗耐药，用于CAR-T细胞筛选，提高筛选效率和疗效,可增加细胞对利妥昔单抗的敏感性降低副作用率，保证安全性,CRISPR/Cas9,CAR-T,