基因诊断与性传播疾病课件模板-005(共30)

1、基因诊断与性传播疾病 课件模板-5,基因诊断与性传播疾病：五、PCR标本的制备,五、PCR标本的制备：,在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应，并使之达到自动化之后，PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单，而且，许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用，因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，处理标本可使待扩增DNA暴露，能与引物复性。,基因诊断与性传播疾病：五、PCR标本的制备,五、PCR标本的制备：,关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多，我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染，且不实用。现介绍

2、一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100，10min，离心取上清作为PCR模板即可。,基因诊断与性传播疾病：六、PCR实验中常见问题对策,六、PCR实验中常见问题对策：,所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。 （一）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因是：Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。,基因诊断与性传播疾病：六、PCR实验中常见问题对策,六、PCR实验中

3、常见问题对策：,所以在实验中出现假阴性失败时，首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循环，一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确，采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。,基因诊断与性传播疾病：六、PCR实验中常见问题对策,六、PCR实验中常见问题对策：,尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3端

4、与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。,基因诊断与性传播疾病：六、PCR实验中常见问题对策,六、PCR实验中常见问题对策：,PCR反应的各温度点的设置要合理。 （二）假阳性：PCR结果的假阳性是对被检测标本而言，而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增，而造成结果判断上的失误，所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。,基因诊断与性传播疾病：六、PCR实验中常见问题对策,六、PCR实验中常见问题对策

5、：,出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，使用一次性吸头。,基因诊断与性传播疾病：七、PCR扩增产物的分析法,七、PCR扩增产物的分析法：,PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定，点杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性，最近发展的一系列产物分析法（PCR-ELIS

6、A,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于产物的精确分析。,基因诊断与性传播疾病：七、PCR扩增产物的分析法,七、PCR扩增产物的分析法：,（一）凝胶电泳分析法 PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。 电泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去离子水漂洗2次，每次15min，于UV灯下观察结果并拍照。,基因诊断与性传播疾病：七、PCR扩增产物的分析法,七、PCR扩增产物的分析法：,凝胶电泳

7、不仅可以鉴定产物的大小，检测扩增的情况，还可以用来纯化扩增产物。 （二）点杂交 当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。,基因诊断与性传播疾病：七、PCR扩增产物的分析法,七、PCR扩增产物的分析法：,放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验，用非放射性物质

8、（生物素、荧光素和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。,基因诊断与性传播疾病：七、PCR扩增产物的分析法,七、PCR扩增产物的分析法：,非放射性标记物质稳定性高，使用方便、安全、检测速度快。 （三）微孔板夹心杂交法 该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果，该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。,基因诊断与性传播疾病：七、PCR扩增产物的分析法,七、PCR扩增产物的分析

9、法：,该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBvDNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。 （四）PCR-ELISA法 本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。,基因诊断与性传播疾病：七、PCR扩增产物的分析法,七、PCR扩增产物的分析法：,因为5端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此，可以通过修饰一个引物的5端使其携带便于PCR产物固定的功能基因，而通过另一引物5-端的修饰使产物便于检测。,基

10、因诊断与性传播疾病：第二章 性传播疾病概论,第二章 性传播疾病概论：,性传播疾病（Sexually Transmitted Diseases， STDs），是指可以通过性接触而传播的一组传染病。我国简称为性病。性病不仅在性器官上发生病变，也可侵犯附属淋巴结及全身重要器官组织。专门研究性病的学科称为性病学。 性病在过去一般只包括梅毒（Syphilis），淋病（Gonorrhea），软下疳（Chancroid），以及性病淋巴肉芽肿（LymphogranulomaVenereum），常称为“四大性病”或“经典性病”，或称“第一代性病”。,基因诊断与性传播疾病：第二章 性传播疾病概论,第二章 性传播疾

11、病概论：,随着社会的发展，特别是近年来西方国家中，以“性解放”、“性自由”为时髦的性俗变化，使性行为多样化，从而使原来四大性病发展至今已有20种以上，所以70年代开始，性病概念逐渐被“性传播疾病”所代替，1975年世界卫生组织（WHO）正式决定用STDs命名。除了“四大性病”外，WHO还把非淋菌性尿道炎、艾滋病（AIDS）、尖锐湿疣、生殖器疱疹、生殖器念珠菌病、细菌性阴道病、滴虫病、疥疮、阴虱、乙型肝炎和股癣等也列入STDs之中。,基因诊断与性传播疾病：第二章 性传播疾病概论,第二章 性传播疾病概论：,STDs从病原体方面可分为：细菌感染，病毒感染，真菌感染，螺旋体，支原体，衣原体，原虫，寄生

12、虫感染。 STDs的病原体及病种 病原分类病原体病种螺旋体梅毒螺旋体（TPM）梅毒细 菌淋病双球菌（NG）淋病杜克雷嗜血杆菌软下疳肉芽肿荚膜杆菌腹股沟肉芽肿真 菌白色念珠菌外阴、阴道念珠菌病病 毒单纯疱疹病毒（型此处缺少一些内容衣原体沙眼衣原体（L1-L3型）（CTS）沙眼衣原体（B-K型）（CTS）性病性淋巴肉芽肿非淋菌性尿道炎，宫颈炎原 虫溶组织阿米巴滴 虫阿米巴痢疾滴虫病寄生虫疥螨阴虱疥疮阴虱病。,基因诊断与性传播疾病：第一节 性病的传播方式,第一节 性病的传播方式：,（一）性行为传播 性交是主要传播方式，占95%以上。传统的性交是阴茎阴道接触，由于西方式的性行为多样化，接吻、口交（生殖

13、器口腔性欲）和肛交（生殖器肛门性欲）等增加了传播机会，人体没有对性病病原体特异性免疫力，任何个体对病原体都是敏感的，而且目前对绝大多数性病没有保护性疫苗可用，当全身和局部抵抗力下降，皮肤粘膜的完整性遭受破坏，不能阻止有毒力且有一定数量的性病病原体到达易感细胞时，则可发生感染。,基因诊断与性传播疾病：第一节 性病的传播方式,第一节 性病的传播方式：,性交之所以传染性病是由于（1）性交的一方生殖器病损中存在有足够数量的病原体，而另一方皮肤粘膜有可能直接接触到病原体。（2）由于性交的磨擦形成皮肤粘膜的损伤（可以是肉眼难以发现的损伤），有利于病原体的进入。（3）过度性交是机体体力下降，抗病能力降低。

14、（二）间接接触传播：通过接触污染的衣服，浴池中或共用浴具等都可间接传播性病。,基因诊断与性传播疾病：第一节 性病的传播方式,第一节 性病的传播方式：,（三）血液和血制品传播：梅毒和艾滋病病毒可通过输血和血制品传播。 （四）器官移植，人工受精传播：如艾滋病。 （五）医源性传播：使用带菌医疗器械通过检查、注射、手术传播给其他病人。 （六）职业性传播：医生、护士、防疫人员防护不严；助产接生手指污染上梅毒；医务人员误将污染HIV的针头和手术刀刺伤自己皮肤。,基因诊断与性传播疾病：第一节 性病的传播方式,第一节 性病的传播方式：,（七）母婴垂直传播：梅毒、衣原体、支原体、HIV。 （八）产道传播：淋菌性

15、结膜炎、衣原体、支原体、HIV感染。,基因诊断与性传播疾病：第二节 性病的流行及现状,第二节 性病的流行及现状：,STDs在全世界广泛流行。近20多年来西方的性自由、同性恋、性犯罪，使欧美国家的性病急剧增加，人们已经认识到STDs对健康及社会影响越来越大，据世界卫生组织统计，全世界每年患性病的人约有3亿，占世界人口的6%。艾滋病发病急剧增加，衣原体感染、新发现的生殖器疱疹成倍增加。目前STDs增加的原因：各种疾病对抗生素抵抗性增强，新的耐药菌株不断产生给有效治疗带来困难；一般女性STDs患者增加，患持久性性病有所增加，如单纯疱疹病毒感染；STDs感染危险性除职业性女性（妓女）以外，STDs已向

16、普通人群中传播并扩大。,基因诊断与性传播疾病：第二节 性病的流行及现状,第二节 性病的流行及现状：,我国的STDs情况极少有公开报导，由于性病诊所全国个人承包化，具体数字也很难统计。我们门诊病人的变化情况具有以下特点：高收入阶层发病率下降，普通收入阶层发病率增加；大城市人口感染率逐渐下降，中小城市人口感染增加；STDs从城市走向农村，农村病人增多；儿童患者增多。 随着感染人群结构的变化，性病种类扩大，而且发生的频度、部位及其症状也随之而发生变迁。,基因诊断与性传播疾病：第二节 性病的流行及现状,第二节 性病的流行及现状：,例如国外淋病多年一直处于领先地位，现在被非淋菌性尿道炎而取代。软下疳、第

17、四性病几乎减少到罕见之列，相反病毒性性病（生殖器疱疹，尖锐湿疣等）逐年剧增，淋病疼痛症状明显减轻，而青霉素无效病例显著增加。 随着科学的进步，大量新的抗生素的出现和广泛应用，促使第一代性病改变了面貌。随着时代的进展，经济发展，社会开放，促使了第二代性病的兴起。,基因诊断与性传播疾病：第二节 性病的流行及现状,第二节 性病的流行及现状：,近年来性行为的变化，如口腔性交、肛门性交的普遍以及同性恋的流行，促使性病内容出现很大变化，病原微生物感染部位在性器官以外的口腔、肛门等处出现。由于口腔性交使口腔、咽部感染，从而在咽部分离出梅毒螺旋体、淋球菌、衣原体等病原体。 第一代性病的病原体均以较大的微生物为

18、主，梅毒螺旋体，淋球菌，软下疳菌，对抗生素较敏感，因而防治比较容易。,基因诊断与性传播疾病：第二节 性病的流行及现状,第二节 性病的流行及现状：,而第二代性病病原体以病毒、衣原体等微小的病原体为主，目前缺乏有效的治疗药物。所以，不论从其传播上、防治上均无上策，从而给控制性病流行带来了难以克服的障碍。 最近性病在临床常见不显示症状或显示轻微症状的病例有所增加，又是现代性病一大特点，既往由于感染性病，局部症状突出而又剧烈，迫使患者早期就医治疗。,基因诊断与性传播疾病：第二节 性病的流行及现状,第二节 性病的流行及现状：,目前，患性病的人群以暗娼为主，而这些暗娼又不受任何约束（如定期体检，患性病者不能从事该职业），使其感染人群不断扩大，加之病原体变易，特别是近代性病以衣原体感染为主流，并伴有多种病毒性性病如疱疹、尖锐湿疣、艾滋病，其症状均较为轻微或无症状型居多，感染者无查觉，仍依旧与其性伴接触，或由嫖娼感染带回家中发生家人感染。,基因诊断与性传播疾病：第二节 性病的流行及现状,第二节 性病的流行及现状：,另外，由于多数嫖客不使用避孕套，也促成感染的日益扩大。目前的现状是国人的防病意识不够，有形成潜在大流行的危险。 随着改革开放，经济飞速发展，对外交流扩大，旅游业的普遍，人们性文化、性习俗也发生着变化，疾病也出现了新的形态与改变，使得