Sanger法测序PPT课件

1、.,第1页,Sanger法测序 -在HLA-SBT分型中应用,2009.10,杨华志 唐金凤 胡志锋 周巧云 杨晓琴,2,目录,HLA的介绍 测序原理Sanger法测序 测序反应操作流程及注意事项 简单的峰图分析,3,HLA的介绍,4,为什么要进行HLA检测,HLA 是迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一，它与同种异体器官移植的排斥反应密切相关，而且该基因的高度多态性在法医学上的亲子鉴定、个人识别以及疾病相关性和人类进化研究方面也起着重要作用。 HLA配型在器官移植中是必要的。HLA的相容性程度（配型的符合程度）是决定移植物长期存活的主要因素之一。,HLA的介绍,.,5,HLA分型,1、血清

2、学分型 2、细胞学分型 3、DNA分型 PCR-RFLP技术 PCR-SSO技术 PCR-SSP技术 PCR-SBT技术,HLA的介绍,6,PCR-SBT: 以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。 SBT法HLA高分辨分型已逐步在欧美国家推广，并成为“金标准”。目前我们华大也以SBT法为主，并结合SSP方法进行HLA的配型。,HLA的介绍,7,PCR-SBT法分型的基本流程,HLA的介绍,back,8,测序原理,双脱氧链终止法（Sanger法）：,1977年，英国人Fred Sanger 发现，如

3、果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。,9,脱氧核糖核苷酸通过形成3,5-磷酸二酯键延长DNA链,测序原理,10,测序原理,11,测序原理,经PCR扩增反应，可以得到一系列长度不同的产物，由于ddNTP带有荧光标记，对产物进行电泳分离，并用相应的仪器进行检测，就可以读出模板的序列。,12,PCR与测序反应的比较,PCR 测序反应 DNA 聚合酶 Taq酶 测序酶 引物 一对 单向 底物 dNTP dNTP+ddNTP* 模板 量少 质量要求高 产物 等长的DNA片段

4、 长短不一的片段 3端带荧光标记,测序原理,back,13,测序反应操作步骤,实验前准备 Mix配制 测序引物稀释 编板号（日期_S位点_测序引物_纯化板编号_（其它） 反应加样 短暂离心后上PCR仪,14,预约PCR仪 编写测序反应表 根据要检测的样品数计算试剂的需要量 查看实验所需的耗材是否够用 用70乙醇擦桌面，不能残留粉尘,测序反应实验前准备,back,15,Mix配制,Step1：按实验需要的体系和用量计算各组分的加量，冰上或4避光缓慢解冻2.5BigDye； 计算公式： 1（V）2.5（VBD）5（VBuffer） 其中V反应体系体积，通常5l； VBD2.5BigDye 体积；V

5、Buffer5Buffer体积,.,第16页,Step2：振荡3秒或颠倒5次混匀，离心10秒，冰上或4避光保存，当天使用；剩余mix可-20保存，避免反复冻融，解冻2次内用完。,常用配方：,17,Mix配制注意事项,对多个使用相同引物的测序反应可以把引物加到mix中 配制mix和稀释引物的millipore水应分别使用； 吸取不同的试剂要换枪头； 试剂打开后应立即吸取并盖好盖子，接触样品的容器、试剂严禁长时间暴露在空气中，时刻防止污染！,back,18,引物稀释,干粉稀释 Step1：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓度应加入的超纯水； Step2：将干粉离心12000rpm， 2min

6、； Step3：加入一定体积的millipore水后盖好离心管盖； Step4：振荡1分钟，室温放置30分钟，使其充分溶解； Step5：再次振荡30秒，离心10秒。,19,引物稀释,液体稀释： 根据以下公式计算（通常使用液浓度3.2pmol/L） 加水量=(储存液体积储存液浓度/使用液浓度)-储存液体积 按预算的体积在1.5mL离心管中加入millipore水，吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振荡30秒，离心10秒，备用。,20,稀释引物注意事项,1、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm离 心30s,干粉引物12000rpm离心2min。 2 、打开干粉引物离心管盖时动作尽量

7、轻缓，打开的角度不超过45。 3、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。 4、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污染。 5、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一一对应写在新的Ep管上。,back,21,反应加样,按测序反应表将待测样本和测序引物摆放到96试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板号后开始加样。 按照反应体系加样：,A、B位点用1/27体系 DR位点用1/20体系 1/27体系 ： 1/20体系： 模板 1.0 L 模板 1.0 L Bigdye（2.5） 0.3L Bigdye（2.5） 0.4L 5buffer 0.85 L

8、5buffer 0.8L Primer（3.2p） 1.0 L Primer（3.2p） 1.0 L 去离子水 1.85 L 去离子水 1.8L - - 5L 5L,.,第22页,加样时注意事项：,1. 使用前检查移液器量程设定是否准确； 2. 使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内不能有残留； 3. 在距管口3-5毫米处贴管壁加微量试剂.,.,第23页,加样时注意事项：,4. 加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足，确认无误后方可进行下一步操作； 5. 加错试剂时立即在测序反应表中记录，在新的板孔中重新

9、加样； 6. 加不同试剂或相同试剂加入含有不同试剂的板孔 中，必需换枪头；,back,.,第24页,上PCR仪：,1. 短暂离心后上PCR仪。 2. 测序反应程序： 96，2min96，10s55， 5s60，2min25cycles15，；,3. PCR仪程序运行结束后冷却到15，退出程序，取下测序反应板，记录PCR仪运行情况；在纯化板左边画上“”代表已上PCR仪；冰箱冷藏区特定位置保存，待纯化，并通知纯化岗同事。,.,第25页,上PCR仪注意事项：,1.上机前确认样品板的孔都加了样品； 2.确认PCR程序是否正常终止； 3.程序结束后，观察每孔是否有蒸干现象； 4.连续使用PCR仪时，两轮

10、之间让机器待机20分钟以上。,back,26,测序检测所用的3730XL,27,测序峰图的简单分析,我们所用的峰图分析软件为： Sequence Scanner V 1.0,.,第28页,整板峰图的大概情况：,.,第29页,原始数据Raw窗口：,30,原因：1、模板质量差；2、模板浓度过高或者过低；3、纯化时样 品丢失；4、引物降解或者加错； 5、Bigdye浓度过低或者失效；6、 水污染；7、PCR仪温度不稳定,解决方案：1、检测模板纯度；2、调节模板浓度；3、换新的引物；4、 提高Bigdye浓度；5、换水；6、检 测PCR仪；7、保证纯化时酒精的浓 度及体积，倒甩时速度不能高于 185g

11、,无反应,.,第31页,测序引物问题：,现象：每个峰后面有个同样荧光信号的小“尾巴”。 原因：合成是引物多一个碱基。 对策：重新合成引物。,现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。 原因：合成时引物少一个碱基。 对策：重新合成引物。,.,第32页,引物或模板不纯：,现象：整个峰图噪音都比较高； 原因：引物或模板不纯； 对策：选用高纯度的引物，或模版纯化要充分。,33,原因：1、模板不纯；2、模板上有两个引物结合位点；3、 加入两个引物；4、退火温度 过低；5、纯化时污染,解决方案：1、优化PCR反应条件；2、重新设计引物；3、提 高测序反应的退火温度；4、加 样及纯化时要防止污染,套峰,34,原因：1、太多的模板量；2、Bigdye稀释过度；3、模板量 过少；4、引物过量；5、模 板纯化不好；6、模板上有不 容易测通的区域（如poly G）,解决方案：1、检测模板浓度及纯度；2、减少反应体积优于提高模 板稀释度；3、检测引物浓度是否 正确；4、检测是否有不易测通的 区域存在。