PCR技术ppt课件

1、PCR技术,生物化学实验技术,1,目录,PCR的反应原理PCR示例,多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction),KaryB.Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,体内DNA的复制体系,DNA聚合酶（IIIIII）,拓扑异构酶解旋酶类SSB,引物dNTPMg2+,Mullis的PCR构思,TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus),酶活性(%),温度(),405060708090100,10080604020,耐热DNA聚合酶,Saiki（1988）将

2、耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。,PCR反应循环,Taq,P1,P2,PCR反应体系,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+,模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+,1）PCR反应成分,（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使

3、反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5）Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数变性使双链DNA解链为单链94，20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量

4、决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸70-75,一般为72延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,PCR技术的特点,1）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为

5、宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3）操作简便易行,利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。,PCR示例,一、实验目的,学习PCR分析的原理与技术。,1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T质粒DNA2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR反应缓冲液25mmol/LMgCl210mmol/LdNTP10mol/L引物1和引物2,二、实验材料、仪器和试剂,1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：10XPCR反应缓冲液2.5L25mmol/LMgCl22.0L10mmol/LdNTP1.0L10mol/L引物11.0L10mol/L引物21.0L质粒DNA1.0LTaq0.1L(5U)水补充至25.0L,三、操作步骤,2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀：10XPCR反应缓冲液2.5L25mmol/LMgCl22.0L10mmol/LdNTP1.0L10mol/L引物11.0L10mol/L