生物化学：第31章 DNA的重组

第31章DNA的重组（自学）同源重组同源重组分子机制-----Holliday模型(Animation

）同源DNA的来源:真核生物：减数分裂时非姊妹染色单体原核生物：细胞间DNA（基因）转移转移方式：结合（Conjugation,需F因子介导），转化（Transformation），转导（Transduction），细胞融合（Cellfusion）主要的酶：RecA蛋白,RecBCD **DNA的重组的生物学意义(一)Holliday模型一、同源重组（自学）(二)细菌的基因转移与重组细菌的结合作用致育因子（F因子）通过结合作用由F+细胞向F-细胞转移，F质粒约1/3的基因与转移有关，traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD蛋白构成转移的通道，在TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上，切开一条链，使其5΄端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。(三)重组有关的酶RecBCD有依赖ATP的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶活性，当DNA断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到chi位（GCTGGTGG)，在其3＇侧4-6核苷酸处将链切断，产生3＇游离单链，随后单链与RecA结合，开始同源区重组。RecA蛋白的丝状聚合体与DNA的相互作用RecA蛋白引起DNA同源重组的模型在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组。（a）

RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。（b）

RuvA/RuvB的作用：（左）RuvA四聚体结合到Holliday位点；（中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心，RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。（右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。（c）

RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。（d）假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。几个重要例子：1.

PhageDNA在细菌染色体DNA的特定位点上的整合或切除（开发：Invitrogen,GatewayTechnology)2.鼠寒沙门氏杆菌的鞭毛蛋白相变3.免疫球蛋白基因重排二、特异位点重组特异位点重组噬菌体的基因重组免疫球蛋白基因的重组IgG的分子结构（1）（2）（3）（4）（5）重组位点有7和9nt的信号序列,中间间隔12或23bp。在不同的核苷酸位点重组可以生成不同的蛋白质三、转座重组McClintock的重要发现

转座子具有反向末端重复序列以及在靶部位两侧产生的同向重复序列。在该例中靶序列为5bp，转座子末端由9bp反向重复序列组成，数字1-9指序列重复碱基对。*两侧正向重复***末端反向重复**(一)细菌的转座因子1.插入因子

两个插入序列之间夹着一段序列（可以是某个基因，如抗性基因）。两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性。2.组合型转座子

插入序列被转座酶基因取代，图示为Tn3(TnA家族）的结构。两端为38bp的反向重复，其两侧为5bp的靶序列，tnpA编码转座酶，tnpR编码的蛋白质可以作为解离酶（使转座子与受体DNA形成的共整合体重组和解离），也可以作为阻丫啶类丫啶类丫啶类3.复合型转座子

两个IS10组件构成一个复合转座子，它能使位于他们之间的任何DNA易位。当Tn10是一个小的圆形分子的一部分时，IS10重复序列可转座至环状分子的任一侧。转座子可用不同的方式转座，转座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色体的断裂、重复、缺失、倒位、易位等变化。4.转座的方式插入序列使靶序列的数量增加，在插入序列两侧各有一个复制转座作用产生了转座子的一个拷贝，它插入到一个接受位点。给予位点保持不变，以致给予者和接受者都有转座子的一个拷贝。非复制转座作用在未被修复的情况下，可能造成致死突变转座子引起DNA的重排，正向重复序列的重组引起其间序列的切除或插入。反向重复序列的重组能引起其间序列反向排列(二)真核生物的转座因子原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子，表现出顺式显性。真核生物的转座酶可以作用于任何末端具有该酶所识别的反向重复顺序的DNA,使其转移到相应的靶位点。在玉米的激活-解离系统（activator-dissociationsystem,Ac-Ds)中，Ac编码转座酶(自主因子)，Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中间序列形成的，无转座酶活性，但随Ac转座后可抑制邻近基因的表达。在玉米的抑制-促进-增变系统（suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En（增强子）序列相似，均为自主因子，与其对应的非自主因子dSmp为有缺陷的Smp因子，转座后，若Smp插入靶基因附近的合适部位，可以促进靶位点基因的表达，若Smp插入外显子，可抑制基因的表达。四、真核生物基因表达的转录前调控1.染色体丢失：如四膜虫的大核为营养核，由小核发育而来，约10%的DNA在发育过程中被丢失。2.基因扩增：如非洲爪蟾卵母细胞的rDNA可以大量扩增，形成1000个以上的核仁。3.基因重排：重排可以使表达的基因发生切换，也可以产生新的基因。4.组蛋白的乙酰化和去乙酰化：组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。组蛋白H4的乙酰化不足(underacetylation)是雌性哺乳动物一条X染色体失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有关。5.染色体DNA的修饰和异染色质化：DNA的甲基化可以使其失去转录活性，高度甲基化的DNA可以形成高度压缩的异染色质，异染色质的基因无转录活性。6.染色质结构改变模型-组蛋白置换

占先模型(pre-emptivemodel)：决定的因素是转录因子和组蛋白谁先占据调控位点。DNA复制时，组蛋白8聚体解离，转录因子乘机结合到调控位点上，一直持续到下一个复制周期，抑制了组蛋白和DNA的结合。

例1：当5SrRNA基因与组蛋白结合时TFⅢA不能激活此基因。而TFⅢA可与游离的5SrRNA基因结合，再加入组蛋白不能使此基因失活。例2：含腺病毒启动子的质粒能被TFⅡD结合，再被RNApolⅡ转录，如先加入组蛋白，则不起始转录，如先加入TFⅡD则形成的染色质中，模板仍能转录。动态模型(dynamicmodel)：组蛋白置换需输入能量。一些转录因子结合DNA时可裂解核小体，或建立一个可产生核小体定位结合位点的边界。如果蝇Hsp70启动子上的核小体在体外实行重建。GAGA(细胞核结合蛋白)转录因子与启动子中4个富含(CT)n位点结合，破坏了核小体，形成一高敏感区，而且导致邻接的核小体重排，这样它们就优先插入到随机位点。核小体打开的过程是需要水解ATP的耗能过程。(一)PCR技术（聚合酶链式原应,PolymerasechainReaction)以目的基因或DNA片段为模板，在引物介导及TaqDNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。五、DNA体外合成技术DNA的酶合成

PCR（PolymeraseChainReaction）①模板DNA（单链）②引物③DNA聚合酶④dATP、dGTP、dCTP、dTTP⑤一定浓度的Mg2+合成方向：5’→3’端

化学合成：方向3’→5’，不需酶和DNA模板。生物合成：方向5’→3’，需模板、引物和酶。反应物（1）模板单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板，若以RNA为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA后才能用于PCR。（2）TaqDNA聚合酶

DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键，从水生栖热菌（ThermusaquaticnsVT-1）分离出来。TaqDNA聚合酶有很好的热稳定性，92.5℃处理130min，仍保留50%的酶活性，在68-74℃活性最高，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。（3）引物引物是决定PCR结果的关键，它由寡核苷酸组成，15-30b（4）核苷酸dNTPdNTP的浓度50-200umol/L。（5）镁离子Mg2+

2.PCR原理

变性95℃

复性55℃

延伸72℃RT-PCR注意事项：1)防止RNA的降解，保持RNA的完整性。2)为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3)内参的设定：用于靶RNA的定量。常用的内参β-Actin（β-肌动蛋白）等。避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。4)PCR不能进入平台期，对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5)防止DNA的污染：A.采用DNA酶处理RNA样品。B.将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。引物：特异性反应的关键，知道任何一段模板DNA序列-设计引物。设计引物：

①引物长度：15-30bp，常用为20-25bp左右。②引物扩增跨度：特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，太少--扩增效果不佳，过多--非特异条带，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体；⑤引物3‘端的碱基（最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，末端碱基不配对--PCR失败。⑥引物（可加合适的酶切位点--酶切分析或分子克隆）。⑦引物的特异性：与其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1

mol或10～100pmol，偏高--错配和非特异性扩增；增加引物之间形成二聚体的机会。(二)cDNA合成(逆转录)以总mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除mRNA，合成第二链。从而得到特定细胞中所有mRNA对应的cDNA。反转录的简要过程表示如下：反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，Oligo(dT)为引物，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementaryDNA,cDNA)，它与RNA模板形成RNA/DNA杂交体,随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。cDNA合成多数反转录酶都具有多种酶活性：1.DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。2.RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RN