植物组织培养-植物组织培养的基本技术

3植物组织培养的基本技术3.1培养基的成分与配制技术3.2基本操作3.3离体培养体系的建立3.1培养基的成分与配制技术成分母液配方pH值制备3.1.1基本成分水矿质元素碳水化合物生理活性物质生长调节剂附加物天然添加物1.水（H2O

）水：可靠的水质是实验的保证可以使用以下装置：水质软化装置离子交换反向渗透蒸馏离子交换设备2.矿质元素大量必需元素（加入mM量级）：氮、磷、钾、钙、镁、硫微量必需元素（加入µM量级）：铁、锰、硼、锌、铜、钼其他：碘、镍、钴、铝等3.碳水化合物作用：提供碳源、维持渗透压。通常碳源用蔗糖，高压灭菌后蔗糖大部分水解为葡萄糖和果糖。浓度范围1～5%，但在幼胚、茎尖、花药等培养时可达10％甚至更高。低浓度（1.5～2.5％）的糖有利于木质部的生长；高浓度（3～4％）有利于韧皮部；4.生理活性物质维生素肌醇氨基酸及其酰胺类单核苷酸维生素（0.1～10mg/L）作用：辅酶注意事项：易高温降解，过滤灭菌。硫胺素（VB1）：全面促进生长。吡哆醇（VB6）烟酸（VB3）VC：抗氧化剂，防止褐变。肌醇作用：帮助活性物质发挥作用，使培养物快速生长，促进胚状体及芽的形成。一般用量：50～100mg/L。氨基酸及酰胺有机氮源、缓冲作用、调节体内平衡。甘氨酸：促进离体根的生长。丝氨酸、谷氨酰胺：有利于花药胚状体或不定芽的分化。水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）：氨基酸混合物。5.植物生长调节剂：目前公认的已用于植物组织培养和生长操作的有六大类植物激素。它们是：生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯和油菜素内酯。此外还有一些具有植物激素特征的化合物。天然生长素在植物中发现的天然生长素主要是吲哚-3-乙酸（IAA）。在植物分生组织区浓度很高，与许多生理反应有关。与植物组培有关的作用主要是在细胞分裂和有丝分裂过程。生长素的一个主要应用是促进生根，因此被广泛用于切段的微繁和生根培养。然而，不可忽视它可抑制根的伸长。合成生长素：最广泛使用的合成生长素：吲哚-3-丁酸IBA、α-萘乙酸（NAA）和2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）。通常与细胞分裂素联用。这些生长素对光、温的稳定性高于IAA，可以经高压灭菌。其余较少用的生长素包括：2-萘氧乙酸（NOA）、4-氯苯氧乙酸（4-CPA）、2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA）、2,4,5-三氯苯氧基乙酸（2,4,5-T）、3,6-二氯茴香酸(麦草畏)、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸（毒莠定）。细胞分裂素

细胞分裂素是腺嘌呤6位上的N被其他基团取代的衍生物，与生长素共同作用促使植物细胞分裂。玉米素是最早被分离的细胞分裂素。呋喃甲基腺嘌呤和苄基腺嘌呤是最早合成的。细胞分裂素主要在植物的根部合成，运输到茎干。在组织培养中对芽的形成和器官分化起主要作用。均二苯脲（DPU）从椰子汁中提取，具有类似细胞分裂素活性，常作为微繁的附加成分。常用的细胞分裂素：苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、激动素（KT）。Thidiazuron（TDZ）已广泛用于组织培养。TDZ抑制细胞分裂素氧化酶，从而降低细胞分裂素的新陈代谢，使得细胞分裂素在组培过程中维持较高的水平。

赤霉素赤霉素对热敏感，因此在组培中不常用。使用时，在培养基高压灭菌后，对它单独过滤除菌。它们主要的作用是刺激植物亚顶端分生组织的扩展生长。因此常用来刺激芽的伸长，如对矮稻的生物测定可明显看到其作用。赤霉酸（GA3）是在组培中用得最多的赤霉素。脱落酸脱落酸（ABA）是植物生长的强有效的抑制剂。与其他生长因子相互起作用。在组培中广泛用来促进体细胞胚发育为成熟的胚，并转化为小植株。乙烯乙烯是气态的，是一种挥发性的激素。要将这种激素降低到最小程度，培养容器大小，尺寸以及密闭方法就显得非常重要。在过去的几年发展了大量的植物生长调节剂。由于它们更强的活性、稳定性以及低廉的价格，在植物组培中它们的用途也不断地扩展。生长素/细胞分裂素相互作用

在Skoog和Miller工作的基础上，已经建立起很好的生长素－细胞分裂素比率关系，用于组培中决定芽和/或根的形成。细胞分裂素对生长素的浓度比值高时，倾向于形成芽，而生长素细胞分裂素的浓度比值高时，倾向于形成根。两种激素的比值处于中间水平时增强愈伤组织的形成。6.附加物胶凝剂螯合剂渗透剂活性炭其他胶凝剂：琼脂：从藻类中提取的天然产品，7～10g/L。琼脂一般都含有杂质，特别是钙、镁和微量元素，在营养研究时应避免使用。Gelrite：一种吉兰多糖（异多糖），是假单胞菌产生的胞外多糖，2.0～2.5g/L。不同品牌其物理化学特征不同螯合剂Chelates可与金属阳离子（主要是铁）形成复合物，使其溶解于溶液中。EDTA：乙二胺四乙酸EDDHA：乙二胺二邻羟苯基大乙酸铁钠渗透剂Osmoticagents

组培培养基的渗透能力影响水和各种成分的可用性。蔗糖的浓度大于2%常常是由于其渗透效果而非作为碳源的作用。大多数情况下甘露醇仅作为有渗透效果的糖醇，而不参与代谢变化。活性炭Charcoal（0.5～3％）使培养基变黑（根部环境）。吸附分子，特别是带有环状结构的植物生长调节剂。可能含有刺激因素（如多胺）。由于吸附能力的不同，活性炭的商标很关键。在高压灭菌前加入会降低培养基的pH值，使琼脂不易凝固。7.天然添加物椰乳（CM）、水解酪蛋白（CH）、酵母提取液（YE）等。作用：提供天然微量营养成分、生理活性物质和生长调节剂等。缺点：成分不确定，影响实验重复性。3.1.2母液（贮备液）10倍、100倍或更高倍数，冰箱贮存。贮备液Ⅰ：大量元素20倍贮备液Ⅱ：微量元素200倍贮备液Ⅲ：铁盐200倍贮备液Ⅳ：有机物质（除了蔗糖）200倍各种激素贮备液分别配制：0.1mg/L或1mg/L注意事项：各种药品要充分溶解后才能混合。混合时要注意先后顺序，避免相互结合生成沉淀。铁盐单独配制，一般用硫酸亚铁和EDTA-Na2通过加热形成稳定的螯合铁贮存。生长素类先用少量95％乙醇或1mol/LNaOH加热助溶后，用水定容。细胞分裂素类先用少量1mol/L盐酸溶解，再用水定容。3.1.3配方基本培养基：MS、B5、White等。激素配比：主要是生长素和细胞分裂素的比例。如：MS+BA2+NAA0.1~0.23.1.4pH值一般5.6～6.0。高压灭菌后稍有下降，所以灭菌前要略调高。大于6.0，培养基变硬；低于5.0，琼脂凝固不好。一般用1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节。培养阶段pH值会改变

3.1.5培养基制备加一定量水，依次加入需要量的母液。加入需要量的蔗糖，溶解，定容。调节pH值。加入需要量的琼脂，加热溶解（要不断搅拌）。分装：在琼脂未凝时（40℃左右凝固）分装，量一般为容器的1/4～1/3，注意不要沾到容器口。封口。灭菌。存放。注意事项：不能高压灭菌的物质，在灭菌后温度下降但琼脂尚未凝固时，在无菌条件下，用过滤除菌法加入。配好的培养基一般应在两周内用完。3.2离体培养体系的建立3.2.1外植体的选择和处理3.2.2培养条件3.2.1外植体外植体（explant）从需要培养的母株分离的一小块植物材料。接种体（inoculum）已经培养的植物材料用于继代培养。地上部比地下部清洁。外植体越小，克服特殊植物病理问题（如病毒、支原体、细菌）的机会越大，但同时也降低了存活率。内部的组织比外部的不易受到污染。不同外植体反应不总是相同。外植体的选择2.外植体的灭菌根据培养容器大小将材料切割成适当大小；流水（自来水）冲洗植物表面；在酒精中晃动几秒钟；HgCL2（0.1～1%）＋吐温（润湿剂）2滴/100ml：3～5min；用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗；商业漂白剂7~15%＋吐温2滴/100ml：10～30min；再用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗几次。注释自来水：除去尘土，清洁剂去掉表面垢污。酒精：70%酒精使蛋白质失活。95%有时被用来溶解外植体表面的腊质层。

NaOCl（商业漂白剂）或Ca(OCl)2：活性在于Cl-和其他氧化反应。

HgCl2活性在于Cl-和使蛋白质失活的重金属。润湿剂（例如：吐温20或80）可以加到上述溶液中。*汞对环境是有毒的，因此汞溶液使用后收集到一个大的容器中。在溶液中加入氨水，汞可以沉淀。兰花花枝的无菌消毒3.2.2培养条件温度光照湿度气相条件温度事实上要对每种特定的植物甚至每一特定阶段调整最优化的温度。对大多数植物日间培养室的温度调节点在22±2°C。夜间的温度通常要低几度。容器内的温度要比室温高（可达5°C）。培养室的一个主要的问题是维持始终如一的温度。保障措施：需要安装一个很大的自动调温器，当温度太高时可以关掉灯光光通常用荧光灯，在架子上平行安放。大多数情况是装在培养室的外面，以避免热。以下的光参数是重要的：光周期和光强光周期大多数情况光周期不是最重要的。通常是16小时光照。为了节省能源和降低安装费培养室内不同架子上的灯不必同时打开。光强适当的光密度是30µmolm-2s-1，这一光强下为混合培养类型。自养型组培则需要达到250µmolm-2s-1。依据不同类型的容器，容器内的光强或多或少被减弱。PARPhotosyntheticactiveradiationPAR＝每秒每平方米波长在400~700nm之间的光子摩尔数

LUX是一个不太合适的单位，因为它基于人眼的敏感性光谱

光谱是光形态建成的因素（植株高度以及叶片伸展）重要的比率：蓝光/红光，红光/红外光谱因灯不同而不同湿度Humidity

培养室的相对湿度（RH）通常不控制。标准容器其顶部空间水蒸气饱和。容器内的RH可以通过不同的装置控制通风，底部冷却，琼脂浓度。容器气体组分在组培容器中顶部空间的成分组成与温室空气有显著的区别，见下表：其他挥发性气体含量微小。componentgreenhouseenvironmentcontainer

atmosphereO222%aslowas4%N277%upto87%CO2

365-1000ppmupto20%water

vapour60-85%±100%ethylene5ppb-100ppb>2ppm顶部空间气体成分对植物生长发育的影响：矮化或白化玻璃化软腐自养/混合营养乙烯伤害矮化或白化有限的气体交换对组培的效应组培容器尽可能密闭，以防止污染。然而，在一个完全密闭的容器中可能出现气体的堆积，对植物生长造成不利，如产量减少、白化病或坏疽。Fig.1:growthreductionFig.2Albinism玻璃化Hyperhydricity玻璃化是在植物组培过程中的一种生理混乱现象。程度有低高之分。程度低的话在培养初期不会遇到大的问题。但程度高的话在培养的各个阶段都有可能遇到严重的问题。玻璃化症状玻璃化的症状通常不易用肉眼观察到。植物易感或培养条件非常不利则会出现可见的症状。培养条件非常不利的例子：细胞分裂素浓度过高水分含量过高容器过于密实胶凝剂浓度过低产生原因原因是多方面的。然而许多因素只是当培养系统的条件没有达到最优化时表现诱导或激发玻璃化。下列可以作为考虑的因素：外植体：种类，栽培变种；继代间隔时间；继代次数；切割方法；在培养基上的放置情况。

培养基：凝胶的浓度和类型；有无液体层；细胞分裂素的种类及水平；盐浓度。容器：气体组成和气体浓度。

环境：温度；光强和光质，湿度；空气流动补救方法培养基成分：培养基用较高浓度的凝胶固化，也可以使用有较高凝固能力的凝胶剂；降低细胞分裂素的浓度。容器特征：不太密实的装置，比如气透性膜