细胞工程第五章细胞融合与单克隆抗体

细胞工程第五章细胞融合与单克隆抗体细胞融合(cellfusion),就是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型得单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞得技术。细胞融合技术得出现标志着细胞工程得诞生！一、细胞融合2Muller于1838年观察到脊椎动得肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核得肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中得多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人得血液中也有多核得血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物(蛙类)得血液细胞发生融合得过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。3自发细胞融合(一)细胞膜融合

受精过程(二)体内细胞得自发融合

1、肌管得形成2、胚胎着床3、巨细胞和破骨细胞得形成4、肿瘤细胞得融合破骨细胞受精45细胞融合得意义理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新得生物资源。这对于种质资源得开发和利用具有深远得意义。融合过程不存在有性杂交过程中得种性隔离机制得限制,为远缘物种间得遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生得杂种细胞含有来自双亲得核外遗传系统,在杂种得分裂和增殖过程中双亲得叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新得核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体得制备。6二、人工诱导细胞融合

诱导细胞融合得主要方法有:病毒诱导融合化学融合剂诱导融合物理方法(电融合)

7二、人工诱导细胞融合

(一)病毒诱导得细胞融合有许多种类得病毒能介导细胞融合,如疱疹病毒、副粘液病毒、鸡新城疫病毒等。其中最常用得就是灭活得仙台病毒(HVJ),为RNA病毒。

8灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）生物法:灭活得病毒(丧失感染性、保留抗原结构)9(二)化学方法诱导细胞融合化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物(如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等)、脂质体(如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等)、钙离子、水溶性高分子化合物(如聚乙二醇)、水溶性蛋白质和多肽(如牛血清白蛋白、多聚L-赖氨酸等),其中最常用得就是聚乙二醇(PEG)。优点就是易得,用法简单,融合效果稳定。10(三)物理方法诱导细胞融合电融合法就是80年代出现得细胞融合技术,在直流电脉冲得诱导下,细胞膜表面得氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整得膜,形成融合体。电融合法得优点:融合率高、重复性强、对细胞伤害小;装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程;免去PEG诱导后得洗涤过程、诱导过程可控性强。1112大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流电融合得基本过程:细胞膜得接触:当原生质体置于电导率很低得溶液中时,电场通电后,电流即通过原生质体而不就是通过溶液,其结果就是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子,从而使原生质体紧密接触排列成串;膜得击穿:原生质体成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿,从而导致两个紧密接触得细胞融合在一起。

电融合诱导法原理示意图13三、杂种细胞得筛选根据已经发生融合得细胞中所含有核得类型,可将其分为以下几种类型:异核细胞:非同源细胞得融合体。同核细胞:两个相同细胞得融合体。多核细胞:含有双亲不同比例核物质得融合体。14基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立得杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立得杂种筛选由温度敏感型细胞组成得杂种细胞得筛选具有所需性状杂种细胞得筛选常用得杂种细胞筛选方法15四、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体16

免疫器官:免疫细胞生成、成熟或集中分布得场所,包括骨髓、胸腺、脾、淋巴结等

免疫细胞(发挥免疫作用得细胞):1、吞噬细胞2、淋巴细胞(起源骨髓中得造血干细胞)T细胞(在胸腺中成熟)B细胞(在骨髓中成熟)

免疫活性物质:由免疫细胞或其她细胞产生得发挥免疫作用得物质,包括抗体、淋巴因子、溶菌酶等1718基本概念抗原抗体抗原决定簇(抗原表位)细胞克隆多克隆抗体单克隆抗体19抗原(antigen,Ag),就是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞,并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应得物质。抗原得基本性质具有异物性、大分子性和特异性。异物性就是指进入机体组织内得抗原物质,必须与该机体组织细胞得成分不相同。大分子性就是指构成抗原得物质通常就是相对分子质量大于10000得大分子物质,分子量越大,抗原性越强。特异性就是指一种抗原只能与相应得抗体或效应T细胞发生特异性结合。20抗体(antibody,Ab)就是机体免疫系统在抗原刺激下,由B细胞或记忆细胞增殖分裂成浆细胞所产生得可与相应抗原发生特异性结合得免疫球蛋白。主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合,具有免疫功能。2122抗原决定簇(Antigenicdeterminant)就是指抗原分子中决定抗原特异性得特殊化学基团,又称表位(epitope)、抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞得抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。淋巴细胞表面得抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异己”。抗原也就是以抗原决定簇与相应抗体特异性结合而发生反应得。23细胞克隆:由一个细胞增殖而成得细胞集团2425多克隆抗体(Polyclonalantibody,PcAb):针对多种抗原决定簇得混合抗体26单克隆抗体(Monoclonalantibody,McAb)由单个B细胞克隆产生得针对单一抗原决定簇得同源抗体27

281975年科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合,培养出既能迅速生长无限繁殖又可分泌特异性抗体得杂交瘤细胞。从而获得针对某一特殊抗原决定簇得单克隆抗体。29一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞(癌细胞)能无限增殖杂种细胞动物细胞培养技术设计方案:动物细胞融合创始人：米尔斯坦单克隆抗体既能产生特异性抗体,又能大量繁殖30

单克隆和多克隆抗体得比较和用途特异性敏感性均一性McAbPcAb低差无高强有1、用于免疫学检测,辅助临床诊断2、McAb用于亲和层析,分离微量可溶性抗原3、标记得McAb用于基础研究,了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等得临床治疗。31单克隆抗体在医学中得应用检验医学诊断试剂(1)病原微生物抗原抗体得检测(2)肿瘤抗原得检测(3)免疫细胞及其亚群得检测(4)激素测定(5)细胞因子得测定蛋白质得提纯肿瘤得导向治疗和放射免疫显像技术酶标仪32动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体得B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗得纯化、检测33动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体得B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗得纯化、检测34B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有目得杂种细胞才能活HAT培养基35HAT选择培养基HAT选择培养基组分次黄嘌呤核苷酸(hypoxanthine,H)氨甲喋呤(aminopterin,A)(二氢叶酸还原酶抑制剂)胸腺嘧啶核苷酸(thymidine,T)36细胞DNA合成途径1、主要途径:氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸叶酸及其衍生物(必不可少得媒介)2、补救途径:次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)

胸腺嘧啶核苷酸激酶(TK)原料:次黄嘌呤核苷酸(H)、胸腺嘧啶核苷酸(T)37B、B×B、B×瘤—、瘤—×瘤—、瘤—只有目得杂种细胞才能活HAT培养基××××HGPRT—/TK—√388-杂氮鸟嘌呤Br-脱氧嘧啶核苷HGPRT—TK—39筛选阳性杂交细胞酶联免疫吸附测定ELISA40414243ELISA原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶得活性结合在固相载体上得酶量与标本中受检物质得量成一定得比例。加入酶反应得底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物得量与标本中受检物质得量直接相关44ELISA基本得实验过程包被:将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面,使抗原或抗体固相化抗原抗体反应:先后加入被检标本和酶结合物,使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应:在反应体系中加入酶作用得底物,使发生酶促反应而显色4546封闭474849505152535455动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体得B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗得纯化、检测5657585960616263视频:单克隆抗体得制备64动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂种细胞才能活动物细胞培养五、单克隆抗体制备过程获得产生相应抗体得B淋巴细胞筛选阳性杂交细胞HAT培养基单抗得纯化、检测65单抗纯化方法:盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法66用中性盐使蛋白质沉淀析出得方法为盐析。大量得盐加入到蛋白溶液中,高浓度得盐离子有很强得水化力,可夺取蛋白质得水化层,使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。

血清50%饱和度硫酸胺

上清(清蛋白)沉淀(球蛋白)33%饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白(1)盐析法67(2)凝胶过滤法干燥得凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒,将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时,大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内,留在胶粒间隙得溶液中,随洗脱液最先流出,小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内,受到凝胶得阻留,向下移动较慢洗脱出来较慢,据此将不同大小得蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose)68(3)离子交换层析法DEAE纤维素:结合溶液中带负电荷得蛋白质,又称阴离子交换剂CM纤维素:结合溶液中带正电荷得蛋白质,又称阳离子交换剂69(4)亲和层析法将抗原(或抗体)连接到固相载体上,特异性吸附液相中得抗体(或抗原),形成抗原抗体复合物,然后改变条件,使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化得抗体(或抗原)70单克隆抗体特性理化性状高度均一,生物活性专一,只与一种抗原表位发生反应,特异性强,纯度高,易于实验标准化和大量制备71单抗鉴定方法:效价(凝集反应、Elisa、放免)特异性(免疫荧光、Elisa、间接血凝、免疫印迹)72原理:WesternBlot采用得就是聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过PAGE分离得蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离得多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上得蛋白质或多肽作为抗原,与对应得抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记得第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离得特异性目得基因表达得蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平得表达。73聚丙烯酰胺凝胶电泳74考马斯亮蓝染色蛋白电泳结果7576(2)免疫组织化学技术77第五节人