重组DNA技术的基本工具课件-高二下学期生物人教版选择性必修32

1．试管牛是有性生殖还是无性生殖？克隆动物呢？体外受精技术主要包括哪些步骤？2．什么是胚胎移植？可供移植的胚胎有哪些来源？该过程谁是供体？谁是受体？胚胎移植实际上是个什么过程？其实质是什么？进行胚胎移植有何优势？3．什么是超数排卵？为何不直接注射性激素来达到目的？同期发情一般选用什么激素？4．什么是胚胎分割？胚胎分割技术属于无性繁殖还是有性繁殖？什么样的胚胎适合进行胚胎分割？囊胚阶段的胚胎要进行分割要特别注意什么？胚胎移植前的性别鉴定，通常选择什么部位的细胞？5．胚胎分割的成功率与分割次数有何关系？还存在哪些问题？温故知新第3章基因工程第1节

重组DNA技术的基本工具

1.基因工程技术需要哪些工具？2.重组DNA技术的基本工具有哪些作用？本节聚焦：“萤火虫”植物会发光，未来代替路灯从社会中来思考：1.科学家通过什么操作使植物发光？2.该方法是否可以使植物持续发光？3.植物的发光性状是否可以遗传给后代？科研人员通过纳米粒子将荧光素酶直接注入到植物体内使植物发光，但这种方法只能使植物持续发光四小时，并且这种发光性状是不能遗传给后代的。从社会中来基因工程——是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。原理：优点：基因重组定向改造生物体的性状1.基因工程的原理、操作水平、操作结果、场所？2.为什么不同生物DNA分子能够连接起来？为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？3.重组DNA技术的三种工具？4.限制酶的来源、作用、结果？限制酶存在于原核生物中的作用？为什么不会切割自身的DNA？5.DAN连接酶的作用、分类？与DNA聚合酶的区别？6.质粒的本质？载体需要具备的条件？载体的分类、不同点？7.如何防止目的基因自身环化、目的基因反向拼接、质粒自身环化？8.DNA粗提取的原理？研磨的目的?低温放置的目的？9.为什么不能选哺乳动物成熟的红细胞？10.二苯胺试剂的使用条件？自主预习重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”如何利用相关工具获得发出荧光的转基因植物？1.以下为“萤火虫”的DNA序列（仅展示一部分）。2.观察该序列，思考选择哪一种工具获取荧光素酶基因？限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’荧光素酶基因任务一：如何获取荧光素酶基因呢？脱氧核糖A磷酸脱氧核糖G磷酸脱氧核糖T磷酸T磷酸脱氧核糖C磷酸脱氧核糖A磷酸脱氧核糖磷酸二酯键氢键知识回顾——DNA限制酶作用的是什么化学键？（一）限制酶的作用：ATCGTAGC5’3’5’3’1、识别双链DNA分子的特定核苷酸序列；2、使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”特点：具有特异性大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。（二）限制酶的来源：主要来自原核生物。限制酶能破坏外源DNA，如侵染细菌的噬菌体DNA，“限制”病毒在细菌内的寄生，而细菌自身DNA经过相应的化学修饰则不会被限制酶破坏。一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”实例1——科学家在大肠杆菌中分离得到了一种限制酶，称为EcoRⅠ

*EcoRⅠ识别序列为GAATTC

*EcoRⅠ可切割识别序列中轴线两侧的GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”（三）限制酶的作用结果：现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC结论：1.不同的限制酶切割形成的黏性末端一般不同；2.不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。SmaI平末端CGCCGGGCGCGC5'3'3'5'CGCCGGGCGCGC识别序列：

CCCGGG切割部位：

CG之间一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

例1.下表为常用的限制性核酸内切酶及其识别序列和切割位点(注:表中Y为C或T,R为A或G)。据图分析,可以得到的结论是(

)

A.限制酶的切割位点都在识别序列的中间B.限制酶切割后都形成黏性末端C.不同限制酶识别的序列不同所以切割后形成的末端也一定不同D.一种限制酶可能识别多种核苷酸序列

D即时练习利用限制酶获取荧光素酶基因①SmaⅠ……C-C-C-G-G-G…………G-G-G-C-C-C……②EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……③TaqⅠ……T-C-G-A…………A-G-C-T……“想一想”：上图DNA分子中有哪些限制酶的识别序列？“剪一剪”：能否选择合适的限制酶获取荧光素酶基因？3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’荧光素酶基因①SmaⅠ平末端②EcoRⅠ黏性末端:AATT(2)使用①SmaⅠ与②EcoRⅠ进行剪切3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’荧光素酶基因3’CCCCTTAAG...AGCT...CTTAA5’5’GGGGAATTC...TCGA...G3’荧光素酶基因(2)使用②EcoRⅠ进行剪切黏性末端:AATT

黏性末端:AATT②EcoRⅠ②EcoRⅠ3’...GGGCCCCTTAAG...AGCT...CTTAAGAGTTGT...5’5’...CCCGGGGAATTC...TCGA...GAATTCTCAACA...3’荧光素酶基因3’G...AGCT...CTTAA5’5’AATTC...TCGA...G3’荧光素酶基因会产生相同的黏性末端思考：如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会产生怎样的黏性末端？G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

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CC

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C

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AA

AA

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GGC

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AA

AA

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C

G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)G

C

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AA

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GGCTTAA

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C

G

缺口怎么办？连接两个片段之间的磷酸二酯键GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG（一）DNA连接酶的作用：二、DNA连接酶——“分子缝合针”（二）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶：（来自大肠杆菌）T4DNA连接酶：（来自T4噬菌体）平末端CGCCGGGCGCGC黏性末端GCTTAAAATTCGE.coliDNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4DNA连接酶二、DNA连接酶——“分子缝合针”DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键【资料1】真核细胞在自然状态下往往难以接受外源DNA分子，即使吸收外源DNA也难以将其整合到自身的基因组上，还会将其降解。【资料2】1967年，科学家发现一种独立于细菌拟核DNA之外且可以进行自我复制的环状DNA分子——质粒，其可以在细菌之间转移，是基因转移的载体。在之后，科学家又相继在真菌和一些植物细胞中发现了质粒。拟核质粒大肠杆菌三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（一）载体的作用：将外源基因送入受体细胞,在受体细胞内对目的基因进行大量复制。二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中(2)载体能稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上对受体细胞无害、易分离(3)有特殊标记基因，便于重组DNA分子的筛选

如：四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因。含有氨苄青霉素的选择培养基筛选真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。（二）载体需具备的条件：（三）载体种类：质粒，噬菌体，动植物病毒1.标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：2．如何提高筛选的准确性

当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。小结基因工程的基本工具限制酶DNA连接酶载体来源：特点：作用部位：结果：磷酸二酯键主要来源于原核生物具有专一性形成黏性末端或平末端作为载体的条件种类:①稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上②有一个至多个限制酶切割位点；③对受体细胞无害、易分离；④有特殊的标记基因。质粒、噬菌体、动植物病毒连接部位：

磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′5′3′3′3′3′5′5′请利用两张纸，按照P73页“重组DNA分子”的要求完成操作。思考讨论：…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATG

AATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAA

AATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′5′3′3′3′3′5′5′请利用两张纸，按照P73页“重组DNA分子”的要求完成操作。思考讨论：1.质粒自身连接--自身环化2.目的基因(荧光素酶基因）自身环化3.两个目的基因连在一起4.一个目的基因与一个质粒连接5.质粒与质粒连接出现连接的情况有：如何完成目的基因和载体的重组？探究•实践DNA分子的粗提取和鉴定DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。2.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。DNA+二苯胺沸水浴蓝色一、实验原理0DNA溶解度NaCl浓度0.14mol/L2mol/L1、选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。思考：能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。二、材料用具2、试剂：试剂作用研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺试剂析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用溶解并提取DNA研磨加酒精析出溶解与鉴定提取上清液二、材料用具1、研磨称取约30g洋葱,切碎,然后放入研中,倒入10mL研磨液,充分研磨。2、提取上清液①在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯中,在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。②也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。使DNA分子从细胞核中释放出来。不可以用滤纸，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。三、实验步骤3、加酒精析出①在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2-3min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;②或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。析出DNA避免破坏DNA。蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。三、实验步骤①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。4、溶解与鉴定将丝状物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。实验组对照组水浴加热2mol/L的NaCl+二苯胺2mol/L的NaCl+丝状物+二苯胺三、实验步骤评价结果：（1）DNA纯度：看提取物颜色（2）DNA的量：看与二苯胺反应颜色的深浅三、实验步骤1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？3.有时会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于D