基因工程的基本操作程序（第二课时）课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章

基因工程

第2节基因工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序（4个步骤）？2、如何获取目的基因？

3、什么是PCR？PCR的条件、过程、结果分别是什么？复习回顾

获取了足够量的目的基因后，可以直接把目的基因导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解

不能原因那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？本节聚焦本节聚焦基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？活动一：请同学们自主阅读教材P80，小组合作思考讨论完成问题。1.基因表达载体的构建的目的？载体还需要哪些结构？各个元件有什么作用？2.目的基因插入什么位置？目的基因插入位点是随意的吗？3.请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。4.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？如果不能，怎么改进？二、基因表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。1目的：二、基因表达载体的构建2组成：DNA复制的起始位点位于基因的上游；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。位于基因的下游；终止转录便于重组DNA分子的筛选和鉴定。能控制表达所需要的特殊性状二、基因表达载体的构建①

用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②

用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。载体基因表达载体3构建过程：二、基因表达载体的构建启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。1.构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？活动二：思考问题,分析基因表达载体构建的目的和方法。二、基因表达载体的构建2.请结合下图思考，使用哪种限制酶同时处理质粒、外源DNA可以正确构建基因表达载体？BamHⅠ和HindⅢ二、基因表达载体的构建总结归纳1：限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。二、基因表达载体的构建(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。二、基因表达载体的构建(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。二、基因表达载体的构建(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。二、基因表达载体的构建总结归纳2：区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子名称启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束二、基因表达载体的构建启动子的类型根据启动子的转录模式，可分为：①组成型启动子

能够调控基因的表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。②组织特异性启动子

其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。其最大的优势是其启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加了转基因的效果。③诱导型启动子

当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。1(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA

连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用

T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用

T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C课堂练习2.(2023·湖北，4改编)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中

能形成菌落D课堂练习将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞新课推进活动三：请同学们自主阅读教材P81—82倒数第二段文字，思考以下问题。1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。三、将目的基因导入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。实质：将目的基因整合到受体细胞基因组中。将目的基因导入受体细胞的方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法显微注射法Ca2+转化法（我国科学家独创）（常用）转化的概念：三、将目的基因导入受体细胞感受态细胞Ca2+处理细胞重组基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA分子42℃,1min冰上3minCa2＋处理

常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。1操作方法：2过程：1、导入微生物细胞：三、将目的基因导入受体细胞显微注射法示意图普通鼠与生长速度加快的转基因鼠目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物①个体大，易操作。②受精卵全能性高，易培养成完整个体。显微注射法1操作方法：2过程：2、导入动物细胞：三、将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因适用生物：开花植物3、导入植物细胞：三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法

转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。②原理：3、导入植物细胞：三、将目的基因导入受体细胞

在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？大型环状DNA（可转移的DNA）农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。三、将目的基因导入受体细胞目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达（2）农杆菌转化法③过程：3、导入植物细胞：三、将目的基因导入受体细胞第一次拼接

是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接

指被插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入

是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。第一次拼接第二次拼接第一次导入第二次导入两次拼接和两次导入：三、将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程农杆菌转化法显微注射技术Ca+处理法体细胞或受精卵受精卵原核细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca+处理细胞→微生物细胞膜的通透性增加形成感受态细胞→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入不同细胞的方法三、将目的基因导入受体细胞A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达3.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是B课堂练习4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中；②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。A.①②B.③④