基因工程的基本操作程序（第1课时）-高二生物课件（人教版2019选择性必修3）2

第二节基因工程的基本操作程序1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉非转基因抗虫棉培育转基因抗虫棉的步骤1目的基因的筛选与获取2基因表达载体的构建3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定一、目的基因的筛选与获取1、目的基因的概念及其种类2、筛选合适的目的基因3、利用PCR获取和扩增目的基因1、目的基因的概念及其种类概念在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因就是目的基因。种类根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。1、目的基因的概念及其种类苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，让棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因——Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。2、筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。例如，对Bt基因及其表达产物有了较深入了解之后才使之成为目的基因。筛选方法认识基因结构和功能的技术方法测序技术的发展；以及序列数据库、序列比对工具等的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。相关信息当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。3、利用PCR获取和扩增目的基因（1）目的基因的获取方法（2）PCR的概念（3）PCR的条件（4）PCR的过程（1）目的基因的获取方法目的基因的获取方法有人工合成法、PCR扩增法、基因文库法等。现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。（2）PCR的概念PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR之歌（3）PCR的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶（体外用高温代替）4种脱氧核苷酸DNA母链DNA聚合酶引物打开DNA双链作为合成DNA子链的原料作为DNA复制的模板催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸①DNA复制所需的基本条件（3）PCR的条件②PCR所需的基本条件耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNMP)通过控制温度使DNA复制在体外反复进行，PCR过程一般在PCR仪中进行。PCR仪可以自动改变温度完成扩增。相关信息真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。不同引物的碱基排列顺序不同，因此引物具有多样性和特异性；PCR扩增的特异性由引物的特异性决定。（4）PCR的过程DNA模板4种脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶引物5'3'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'5'3'5'3'5'3'3'5'变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。复性

当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸

当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。循环（4）PCR的过程3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。5'3'3'5'3'5'3'5'PCR每次循环一般分为变性、复性和延伸三步。每次延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板，因此每循环一次目的基因的数量可以增加一次，即指成数形式扩增约为2n，其中n为循环次数，扩增n次共需要（2n+1-2）个引物。如果首次扩增的模板DNA比目的基因长，那么扩增n次后，目的基因的数量为（2n-2n）个，即从第三次扩增才开始出现目的基因。mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA（互补DNA）再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。旁栏思考用PCR可以扩增mRNA吗？？总结一下cDNA的概念。1、构建基因表达载体的目的2、基因表达载体的组成3、构建的方法二、基因表达载体的构建1、构建基因表达载体的目的让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2、基因表达载体的组成基因表达载体的构建这一步是基因工程的核心。基因表达载体是载体的一种，包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等。2、基因表达载体的组成（1）目的基因：指外源DNA分子的有效片段。（2）启动子：启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类所需的蛋白质。（3）终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录过程终止的信号。（4）标记基因的作用：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为标记基因。3、构建的方法重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？旁栏思考将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。

同一种限制酶切割获得的目的基因和载体混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有（仅考虑两两连接）：自连片段间两两连接目的基因自身环化载体自身环