重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修32

树：不能发光萤火虫：能发光愿望发光树从社会中来普通棉花转基因抗虫棉苏云金杆菌毒蛋白基因毒蛋白杀死害虫抵御番木瓜环斑病毒棉铃虫基因成功的愿望第3章基因工程1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。科技探索之路

基因工程的发展历程基因工程基因工程：是指按照人们的愿望，通过

等技术，赋予生物

，创造出更符合人们需要的

。从技术操作层面看，由于基因工程是在

水平上进行设计和施工的，因此又叫作

。(P67章首页)1.基因工程技术手段？结果？操作水平？目的？定向改造生物体的性状基因重组转基因新的遗传特性新的生物类型和生物产品DNA分子重组DNA技术概念分析：(原理)本质：基因在空间上转移并成功表达2.基因工程技术引起的生物变异类型？拼接的基础1.DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）表达的基础2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息的传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码接剪运想一想：基因在空间上为什么能发生转移并可成功表达？第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具基因工程目录/CONTENTS0102“分子手术刀”“分子缝合针”03“分子运输车”

限制酶名字的由来EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶例如：流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindIHindIIHindIII资料卡1.来源：主要从

中分离纯化出来（限制酶是一类酶，有数千种）根据P71内容，说说限制酶的相关问题：一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”简称：限制酶课P.72原核生物限制性内切核酸酶——“分子手术刀”TGCATAAT5'3'5'3'磷酸二酯键限制酶2.作用：3.识别序列:

限制酶的识别序列由

个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量。大多数6能够识别

的

并使每一条链中特定部位的

断开。限制酶作用部位双链DNA分子特定核苷酸序列磷酸二酯键思考：限制酶所识别特定核苷酸序列有什么特点呢？4.结果:限制酶(EcoRⅠ)能识别

序列，并在

和

之间切________

键,形成

末端。-GAATTC--CTTAAG-GA黏性磷酸二酯EcoRI5'5'3'3'黏性末端中轴线SmaI5'5'3'3'平末端限制酶(SmaⅠ)能识别

序列，并在

和

之间切割形成

末端。-CCCGGG--GGGCCC-GC平产生黏性末端或平末端碱基沿双链DNA中轴线两侧反向对称重复排列(回文序列）P71

旁栏思考题P74

练习与应用

你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。1.想一想，为什么限制酶不切割细菌（原核生物）本身的DNA分子？原核生物DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰对比思考甲基化限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？限制酶只能识别并切开双链DNA分子“两个特定”双链DNA特定核苷酸序列，特定部位的磷酸二酯键断开。课堂活动（课本P73思考·讨论）

请你找到下列序列中EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行切割。限制酶请在两张纸上分别写上右边的两段DNA序列获得目的基因要用限制酶切几个切口？产生几个黏性(平)末端？2个切口，4个黏性(平)末端。PP…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′

待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘起来。DNA连接酶含有相同黏性末端DNA片段的碱基间可互补配对①…CTGCA

…G②…G…CTTAA③

G…ACGTC…④AATTC…

G…A.①③；②④B.①②；③④C.①④；②③

D.以上都不对

缺口怎么办？【反馈练习】找找含有相同黏性末端的DNA片段？思考：①③和②④分别是由同种限制酶切割形成的黏性末端吗？1.作用：2.种类和差别：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源________________________功能只缝合__________缝合____________和____________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体可互补的黏性末端可互补的黏性末端平末端

(效率较低)磷酸二酯键将切下的DNA片段拼接成新的DNA分子二、DNA连接酶——“分子缝合针”（重组DNA分子）旁栏思考题DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?DNA连接酶AG

T

AC

TA

A

T

DNA母链DNA聚合酶DNA聚合酶T……T……A……A……T……A……T……C………G………二DNA连接酶—“分子缝合针”DNA连接酶:一种能够将两个DNA片段连接起来的酶DNA聚合酶:将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上旁栏思考题DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?（恢复磷酸二酯键)比较与DNA相关的五种酶名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个或多个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸下图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A.①②③④ B.①②④③C.①④②③ D.①④③②C【反馈练习】小结可连接黏性末端可连接黏性末端和平末端

(效率低)？？1.载体的作用是什么？2.有哪些种类？3.作为载体应具备什么条件？三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”阅读教材P73，回答下列问题：提示：①载体能与外源基因连接需具备什么条件？②载体要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在需具备什么条件？③我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？1.作用：2.种类：三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”将外源基因送入受体细胞质粒、噬菌体和动植物病毒等。

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。(1)有

，供外源DNA片段（基因）插入其中。一个至多个限制酶切割位点(3)具有特殊的

，

。标记基因(2)能在受体细胞中进行

或

上，随受体DNA同步复制。自我复制整合到受体DNA如抗生素的抗性基因（氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因）便于重组DNA分子的筛选3.作为载体应具备的条件在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。【核心探讨】标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。特殊的标记基因也可以是荧光蛋白基因

重组DNA分子细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”(1)化学本质不同①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。(2)功能不同①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。

随着生物技术的飞速发展，生产和消费“分子工具”的公司大量涌现。感兴趣的话，你可以登录这些公司的网站，查询和了解相关产品的特点、价格和使用说明等。有些这样的公司已经上市，你还可以通过分析公司的股票价格走势，大致了解公司的运营状况以及投资者目前对该行业的认可程度。

在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。到社会中去到社会中去【实验设计思路】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。1.提取原理（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。一、实验原理2.鉴定原理在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。

00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度DNA的粗提取与鉴定二、材料用具DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。不能选择哺乳动物成熟的红细胞。1.选材：原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。2.试剂：试剂研磨液体积分数为95%的酒精二苯胺2mol/L的NaCl溶液蒸馏水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl缓冲液稳定DNA取材研磨析出DNA鉴定提取上清液取上清液充分研磨纱布过滤95%冷酒精离心离心丝状物沉淀物三、方法步骤3404称取

，切碎，放入研钵，倒入

，充分研磨。1.取材研磨——洋葱研磨液（破碎细胞）三、方法步骤溶解并提取DNA3504在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取

。2.提取上清液——上清液上清液（去除杂质）3604在上清液中加入体积相等的、

溶液,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。3.析出DNA——预冷的酒精白色丝状物用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。析出DNA，使DNA与杂质分开3704实验组：将丝状物或沉淀物溶于

溶液中，加入

试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min4.鉴定DNA——二苯胺2mol/L的NaCl空白对照组：在等体积的

中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。

对照组实验组NaCl溶液四1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？观察提取的DNA的颜色：如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定：呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。

本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？四、结果分析与评价小结1.

DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（

）

A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键

B.

能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键

C.

能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键

D.

只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（

）

A.大肠杆菌的质粒

B.

切割DNA分子的酶

C.

DNA片段的黏性末端

D.

用来识别特定基因的DNA探针CA一、概念检测P74练习与应用SpeⅠ_______HindⅢ_________XbaⅠ_______XhoⅠ______

_2.（拓展2第1问）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？

为什么？3.（拓展2第2问）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端

，这在基因工程操作中有什么意义？AGCTCTAGCTAGTCGA二、拓展应用2（改编）1.哪几种限制酶切割可以形成黏性末端？请写出对应的黏性末端（注意：从5’往3’读）切割位点的选择范围扩大XbaⅠ两者切割产生了相同的黏性末端平末端（同尾酶）A片段B片段B片段B片段B片段3．据图所示，

有关工具酶功能的叙述不正确的是()A.限制性内切核酸酶可以切断a处B.DNA聚合酶可以连接a处C.解旋酶可以使b处解开D.DNA连接酶可以连接c处6．(2023·江苏南京高二期中)下列关于如图所示黏性末端的说法，错误的是()

A．DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键B．甲、乙